Накопление щелочелабильных связей в клетках ДНК человека. Исследования тонких изменений структуры хроматина в фибробластах человека

Для устранения осложнений, связанных с возможным образованием разрывов в фазе репликации ДНК, использовали только культуры клеток, находящиеся в состоянии сомкнутого монослоя, когда вследствие контактного торможения митотическая активность клеток прекращалась.

Кроме того, чтобы исключить образование в ДНК таких разрывов, за 24 часа до снятия клеток со стекла среду их роста заменяли на свежую, не содержащую меченого тимидина. Далее клетки наслаивали на 5‑20 %‑ный градиент сахарозы, содержащий также другие вещества в определенных количествах, специально подобранные, чтобы избежать артефактов при центрифугировании ДНК.

Как видно из рис. 8, седиментограмма ДНК "старых" фибробластов сдвинута вправо по сравнению с седиментограммой ДНК эмбриональных фибробластов, а среднее значение массы первой меньше массы второй. Эти результаты можно с большой вероятностью интерпретировать как доказательство накопления с возрастом в ДНК однонитевых разрывов и щелочелабильных связей (апуриновых участков, алкилированных фосфатных групп и т. д.).

Изменения ДНК в клетках, полученных от старых людей, а также в клетках культур последних пассажей не были для нас неожиданными. Однако теоретически непредсказуемый результат был получен при сравнении ДНК диплоидных фибробластов эмбрионального происхождения и ДНК фибробластов, полученных из кожи молодых здоровых доноров (в возрасте 25–30 лет).

Эти данные позволяют утверждать, что в клетках ДНК человека начинается накопление щелочелабильных связей, когда организм еще молод. Особенностью диплоидных фибробластов является то, что их митотический потенциал уменьшается начиная с периода эмбрионального развития. И если такое уменьшение принять за общий критерий старения клеток, то получается, что диплоидные фибробласты начинают "стареть", вероятно, еще до того, как закончился период эмбрионального развития организма. Возможно, тогда же начинается и накопление спонтанно возникающих повреждений ДНК.

В 1984 году группа французских ученых из Института исследований рака (А. Мациейра‑Коэлхо с сотрудниками) подтвердила наши (А. Н. Хохлова и автора этих строк) данные, опубликованные в 1978 году. Речь идет о появлении низкомолекулярной ДНК в культурах фибробластов человека, если эти фибробласты исчерпали свой митотический потенциал (т. е. исследовали культуры, находившиеся на последних пассажах).

Как и мы, французские коллеги исключили возможность образования такой ДНК в процессе лизиса клеток (вследствие действия на ДНК щелочи, детергента или клеточных ферментов). Они также обнаружили существенные изменения хроматина у "старых" фибробластов. Но что особенно интересно, если клетки в течение длительного времени обрабатывали гидрокортизоном, то по крайней мере у ядрышка старение структуры хроматина значительно задерживалось. Это может быть молекулярным механизмом задержки старения, поскольку уже относительно давно известно, что под влиянием гидрокортизона митотический потенциал фибробластов, продолжительность жизни их культур in vitro существенно возрастают.

Недавно для исследования тонких изменений структуры хроматина в фибробластах человека использовали специальный анализатор его изображений, полученных на электронных микрофотографиях с помощью телевизионного сканирующего устройства. Таким образом, можно было судить о плотности нитей хроматина, их длине и ширине. Группа того же крупнейшего в мире специалиста по культивированию клеток и их старению in vitro А. Мациейра‑Коэлхо, проводившая эти исследования, пришла к заключению, что наблюденные ими изменения хроматина отражают деградацию ДНК в процессе старения клеток in vitro, т. е. согласуются с изменениями ДНК, которые мы, а затем они (а также ученые в США и Японии) наблюдали с помощью методов центрифугирования и других физико‑химических методов.

Данные зарубежных исследователей находятся в согласии и с другими нашими данными – о накоплении повреждений ДНК при старении клеток в организме. Правда, изучались не полностью идентичные клетки. Мы исследовали фибробласты, взятые из тканей эмбрионов‑абортусов и из кожи здоровых взрослых людей различного возраста; группа А. Мациейра‑Коэлхо исследовала клетки доноров разного возраста, хранившиеся в замороженном состоянии в клеточном банке Национального института старения США. Авторы обнаружили прямую корреляцию между возрастом людей – доноров исследованных клеток и выраженностью изменений хроматина в этих клетках (которые, как отмечалось, они рассматривают как показатель деструкции ДНК).

К содержанию книги: Биология человека. Причины старения организма и долголетие