ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ ЧЕЛОВЕКА

 

Ограниченная способность клеток к делению – старение клеток. Процесс старения на клеточном уровне. Механизм  детерминации продолжительности жизни

 

 

Новая (точнее, хорошо забытая старая) концепция ограниченной способности клеток к делению в настоящее время получила такую известность и столь полное признание, что о ней можно теперь прочитать даже в "Британской энциклопедии" [The New Encyclopaedia Britannica, 1989, vol. 1, p. 148]: "Лабораторные эксперименты показали, что клетки, взятые из сложных организмов, проходят лишь ограниченное число клеточных делений до своей гибели, подтверждая идею, что клеточные события могут вызывать старение".

 

Работы же Хейфлика, подтверждающие эту концепцию, стали рассматриваться как пример научной революции в биологии [Witkowski, 1987]. Здесь, казалось бы, пришло самое время поставить точку в этой длинной истории со счастливым концом, однако есть серьезные основания считать, что она еще не закончилась.

 

В 1978 г. нами была проведена ревизия концепции Вейсманна— Свима—Хейфлика, в результате которой были сделаны следующие выводы [Гаврилов, Гаврилова. 1978; Гаврилов. ЯгужинСкая, 19781:

 

1.         Массовая гибель клеток в фазе И по Свиму или в фазе III по Хейфлику — это методический артефакт, обусловленный повреждением клеток в результате процедуры пересева (обработка клеток трипсином и их последующее суспендирование). Если же оценить вероятность гибели клеток вне периодов пересева, то оказывается, что вероятность смерти клеток не увеличивается с возрастом культуры, т.е. нет оснований говорить о старении на клеточном уровне.

 

2.         Основное содержание феномена Свима—Хейфлика in vitro — это накопление в культуре постмитотических клеток, полноценных в метаболическом отношении. Процесс образования этих метаболически полноценных постмитотических клеток больше напоминает дифференцировку клеток, чем их повреждение и старение. К этому же выводу одновременно с нами пришли и другие исследователи [Bell et al., 1978].

 

3.         Накопление в культуре постмитотических клеток не сопровождается уменьшением абсолютного числа делящихся клеток в расчете на всю образующуюся клеточную популяцию. Иначе говоря, происходит не исчезновение делящихся клеток, а лишь разбавление культуры постмитотическими клетками. Следовательно, нет никаких оснований говорить об ограниченной способности к делению всех клеток в культуре. Напротив, например, в культуре эмбриональных фибробластов человека имеются клетки, совершающие около 170 делений (вместо общепринятых 50) и обладающие свойствами стволовых клеток с неограниченной способностью к делению.

 

Теперь рассмотрим сделанные выводы несколько более подробно, для чего обратимся к анализу методики культивирования клеток, состоящей в следующем. Образец ткани (например, кожи) помещают в сосуд с культуральной средой и ждут, когда из этого первичного эксплантата часть клеток мигрирует на поверхность флакона и, размножившись, образует сомкнутый монослой, покрывающий дно сосуда. Никто не знает при этом, сколько клеток мигрирует из трансплантата и сколько делений они совершают. По мнению Голд- штейна и соавторов, эта процедура соответствует примерно 10 удвоениям популяции [Goldstein et al., 1975]. В случае же эмбриональной ткани легкого ее обрабатывают трипсином, и суспендированные клетки пересевают в сосуд с питательной средой [Hayflick, 1968].

 

После того как культура клеток образует монослой, ее пересевают, обрабатывая 0,1%-ным раствором трипсина, суспендируя и перенося желаемое число клеток в новые сосуды с питательной средой. Пересев в отношении 1:2 означает, что только половина клеток, образовавших сомкнутый монослой, пересевается в сосуд с той же поверхностью. Когда и в этом сосуде в результате деления клеток образуется монослой, считают, что произошло удвоение клеточной популяции, соответствующее в среднем одному делению клеток. Подобную операцию повторяют многократно (в случае эмбриональных фибробластов человека около 50 раз), до тех пор, пока культура не потеряет способности к быстрому восстановлению своей численности. Теперь попытаемся оценить число делений, которое совершают клетки.

 

Известно, что через сутки после операции пересева в живых остается только 50—70Х клеток "молодых" культур и лишь 25% клеток "старых" культур (эти клетки являются более крупными и сильнее всего повреждаются при суспендировании) [Гаврилов, Гаврилова, 1978; 19821  . Таким образом, 40—60 пересевов соответствуют не 40—60 удвоениям популяции, а 80—120 удвоениям, которые совершают выжившие клетки. Далее, одно удвоение клеточной популяции соответствует одному делению клеток лишь в том случае, если все клетки способны делиться. На самом же деле доля делящихся клеток сильно уменьшается при культивировании и к последнему пересеву составляет всего 10—20Х [Там же]. Можно показать, что в том случае, когда только 10Х клеток сохраняет способность к делению, им необходимо поделиться 10 раз, чтобы численность всей культуры удвоилась [Гаврилов, Ягужинский, 1978; Гаврилов, Гаврилова, 1982]. Если учесть это обстоятельство, то окажется, что 80—120 удвоений численности клеток соответствуют 170±30 делениям. Итак, оказывается, что 50 пересевов клеток человека соответствует не 50, а 170±30 делениям.

 

Самое главное, однако, состоит в том. что и это число делений оказывается не окончательным. Дело в том, что гибель клеточной культуры определяется весьма своеобразно. Оказывается, культуру клеток называют мертвой лишь потому, что в течение произвольно заданного интервала времени (обычно от одной до четырех недель) ее численность не возрастает до желаемой величины (обычно задается численность, в два-четыре раза превышающая исходную) Более того, в "мертвых" культурах еще остается 10—20Х клеток, способных делиться, поэтому культура может компенсировать естественную гибель клеток (которая, кстати, не увеличивается) и даже медленно расти [Гаврилов, Гаврилова. 1978; 19821.

 

Оказалось также, что абсолютное число делящихся клеток в расчете на всю образующуюся клеточную массу не уменьшается, а происходит лишь их разбавление неделящимися клетками. В результате, когда доля делящихся клеток становится близка к 10%, культура действительно не может расти столь быстро, чтобы ее считали живой. Таким образом, феномен "гибели" культуры клеток не только не эквивалентен гибели клеток, но даже не означает того, что все клетки культуры имеют ограниченную способность к делению. В результате проведенных исследований нами был сделан вывод, что в культуре клеток происходит их дифференцировка с образованием неделя- щихся клеток, но некоторые клетки культуры являются стволовыми и могут размножаться неограниченно [Гаврилов, Ягужинский, 1978].

 

Некоторые из сделанных нами выводов были одновременно и независимо подтверждены другими авторами [Bell etal., 1978, p. 1160]: "...одной из наименее документированных особенностей гипотезы старения in vitro является общепринятое утверждение о том, что клетки в фазе 3 являются нежизнеспособными и в конце концов погибают. Это утверждение не имеет никакого серьезного экспериментального подтверждения ...Наш опыт свидетельствует о том, что сам по себе пересев неизбежно приводит к потере клеток. ...Мы наблюдали выживаемость фибробластов крайней плоти (штамм 1519) в культуре в течение длительного периода после того, как клеточное деление прекращалось. Наши первые культуры клеток штамма 1519 поддерживались живыми в среде Хэма ...в течение 22 месяцев и в течение периода от года до 14 месяцев после прекращения клеточных делений ...Биохимические исследования показали, что, несмотря на то что клетки фазы 3 отличаются в некоторых отношениях от клеток фазы 2, они, по существу, нормальны. ...Сообщения о биохимических различиях между клетками в фазе 2 и фазе 3 отражают различия в дифференцировке, а не в возрасте» .

 

Впоследствии и сам Л. Хейфлик совместно с Т. Матсумурой и 3. Зеррудо [Matsumura et al., 1979] подтвердил отсутствие массовой гибели клеток в фазе III по его классификации. Авторы этой работы в течение шести месяцев поддерживали "мертвые" культуры, некоторые из которых за это время в 16 раз увеличили свою численность. Никаких признаков приближающейся массовой гибели клеток обнаружить не удалось, хотя срок наблюдения за "мертвыми" культурами иногда превышал даже год (для сравнения отметим, что вся предшествующая процедура 50 пересевов занимает обычно шесть- восемь месяцев) [Hayflick, 1968].

 

В результате этих исследований Хейфлик изменил свое представление об ограниченной продолжительности жизни клеточных культур. Первоначально он излагал свои результаты следующим образом (рис. 54): "Мы обнаружили, что фибробласты, взятые от четырехмесячного человеческого эмбриона, удваивались таким образом в числе в среднем 50 раз (от 40 до 60). Истощив свою способность к делению, клетки гибли" [Hayflick, 1968, р. 35]. В работе 1979 г. приведена уже принципиально иная схема (рис. 55) и все излагается иначе: "В ранней фазе III культура еще пролиферирует, хотя скорость пролиферации снижается. В последней фазе III клеточная пролиферация очень низка... В течение этого периода не наблюдалось ни признаков окончательной смерти культуры, ни спонтанного приобретения неограниченного пролиферативного потенциала" [Matsumura et al., 1979, p. 332, 333]. Следует подчеркнуть, что изменение позиции исследователя делает ему честь как ученому, поскольку цель науки состоит не в отстаивании догматов, а в поиске истины. Однако достойно сожаления то, что вскрывшаяся истина стала известна лишь очень узкому кругу специалистов, а в таких ведущих научно-популярных журналах, как "Scientific American", продолжалась реклама старой легенды, что "в конце концов клетки претерпевают различные дегенеративные изменения и гибнут" [Hayflick, 1980, р. 42].

 

Конечно, удивительно, что пропаганда этого мифа велась тем же автором, который годом ранее так хорошо показал его несостоятельность, однако эта загадка выходит за пределы тематики данной книги . В то же время становится понятен механизм канонизации устаревших представлений о пределе клеточных делений в современных томах таких солидных изданий, как например. "Британская энциклопедия".

 

Нетрудно заметить, что с учетом новых фактов феномен Свима— Хейфлика уже не столь очевидным образом связан с проблемой ограниченной продолжительности жизни организмов. Действительно, массовая гибель клеток могла бы приводить к гибели организма, в то время как из снижения темпов роста клеточной популяции ограниченность сроков жизни организма прямо не следует. Более того, снижение митотической активности часто является нормальным физиологическим процессом, связанным с дифференцировкой клеток. Например, при образовании нервной и мышечной ткани клетки практически теряют способность к делению, и по приведенному выше определению данные клеточные популяции могли бы быть названы мертвыми. Ясно, однако, что такое определение малоконструктивно, поскольку речь идет о высокоспециализированных и функционально полноценных клетках. Действительно, во многих случаях выполнение высокоспециализированной функции оказывается несовместимым (по крайней мере, одновременно) с клеточным делением. Известно также, что при дифференцировке клеток для переключения их метаболизма часто бывает необходимо клеточное деление, причем критический пункт в таком переключении совпадает с синтезом ДНК [Гаврилов, Гаврилова, 1978; 1982]. Таким образом, наблюдается явное сходство между счетом делений, происходящим при дифференцировке клеток, и счетом делений, наблюдаемым при их длительном культивировании.

 

Естественным образом возникает гипотеза, что явление, обнаруженное Сеймом и Хейфликом, представляет собой не какой-то принципиально новый процесс типа старения на клеточном уровне, а давно известный, хотя и малоизученный процесс диффе- ренцировки клеток, сопровождаемый счетом делений и снижением миготической активности [Bell etal., 1978; Гаврилов, Гаврилова. 1978; 1982; Гаврилов, Ягужинский. 1978]. К сожалению, относительно фибробластов человека до сих пор нельзя сказать, во что именно они дифференцируются в культуре. Возможно, что недостаточность культуральной среды по тем или иным факторам сдерживает нормальную экспрессию нового фенотипа. В принципе известно, что при определенных условиях фибробласты способны дифференцироваться в культуре с образованием неделящихся адипоцитов, однако экспрессия этого нового фенотипа может сдерживаться при недостатке ряда факторов, например инсулина, биотина и пр. Относительно же культур эпидермальных кератиноцитов человека прямо показано, что снижение темпов роста этих культур сопряжено с дифференцировкой (кератинизацией) кератиноцитов [Rheinwald, Green, 1977].

 

Исходя из гипотезы дифференцировки, можно ожидать, что число

удвоений клеточной популяции вовсе не является фундаментальным

внутренним свойством клеток, как полагает Хейфлик, а может быть

сравнительно легко увеличено с помощью ингибиторов дифференте

цировки (некоторых факторов роста, опухолевых промоторов и т.д.). Действительно, оказалось, что эпидермальный фактор роста увеличивает число удвоений клеточной популяции с 50 до 150 удвоений с одновременным увеличением "времени жизни" культуры примерно в три раза. При этом увеличение "времени жизни" культуры сопровождалось задержкой проявления многочисленных признаков терминальной дифференцировки кератиноцитов [Rheinwald, Green, 1977].

 

Другое предсказание гипотезы дифференцировки состоит в том, что, вопреки утверждению Хейфлика, постоянный активный рост клеточных культур может наблюдаться отнюдь не только у трансформированных гетероплоидных клеток, а возможен и для нормальных диплоидных (если эти клетки не вступают на путь терминальной дифференцировки). Действительно, оказалось, что нормальные диплоидные эмбриональные клетки мыши, которые в обычных условиях испытывают кризис роста через 7—10 удвоений популяции, можно успешно культивировать без всяких признаков приближающегося кризиса роста, по крайней мере, в течение 200 удвоений популяции, если только изменить состав культуральной среды (исключить сыворотку крови и добавить ряд компонентов, включая уже упоминавшийся эпидермальный фактор роста). При этом клетки, способные, по-видимому, к неограниченному размножению, остаются диплоидными и незлокачественными [Looetal., 1987].

 

Практически неограниченную способность к пролиферации некоторых нормальных диплоидных клеток можно наблюдать не только в культуре (in vitro), но и в условиях целостного организма (in vivo). Этим свойством обладают, например, нормальные клетки имагиналь- ных дисков дрозофилы, если отсутствуют индукторы их дифференцировки [Finch, 1976], а также гемопоэтические стволовые клетки [Harrison, 1984].

 

С учетом перечисленных выше фактов приходится признать, что концепция Вейсманна—Свима—Хейфлика должна быть пересмотрена, особенно в части тех дополнений, которые были внесены Хейфликом [Hayflick, 1968]. Хотя данная концепция пользуется огромной популярностью, особенно среди исследователей, далеких от клеточной биологии [Fries, 1980; Benjamin, 1982], в настоящее время неясно, какое отношение к продолжительности жизни организмов имеют результаты, полученные при изучении клеточных культур. Не исключено, что ограниченная способность части клеток к делению довольно косвенно связана с ограниченной продолжительностью жизни организмов. В пользу этого вывода свидетельствует также тот факт, что организмы, построенные в основном из постмитотических клеток (лабораторные дрозофилы), имеют принципиально те же закономерности распределения продолжительности жизни, что и человек.

 

Вместе с тем очевидно, что переход части клеток в постмитотическое состояние создает предпосылки к снижению регенераторных возможностей организма и в конечном итоге к уменьшению числа функционирующих клеток, что действительно наблюдается с возрастом [Лэмб, 1980; Walton, 1982]. Поэтому исследование кинетики клеточных популяций на разных этапах жизни организма может иметь важное значение для выяснения механизмов, определяющих продолжительность жизни. Однако попытки обосновать существование генетически запрограммированного предела продолжительности жизни ссылками на предел клеточных делений нельзя признать убедительными.

 

Ключ к механизму детерминации продолжительности жизни лежит не столько в выяснении причин снижения темпов пролиферации, сколько в выяснении причин гибели и повреждения клеток, а также других структур организма. Показательно, что один из авторов рассматриваемой концепции предела клеточных делений тем не менее сам отвергает гипотезу генетической программы и отстаивает гипотезу накопления повреждений (износа) [Hayflick, 1988].

 

 

 

К содержанию книги: Биология продолжительности жизни

 

 

Последние добавления:

 

Биогеронтология. Старение и долголетие человека

 

ПАЛЕОПАТОЛОГИЯ. БОЛЕЗНИ ДРЕВНИХ ЛЮДЕЙ

 

 ГЕОЛОГИЯ БЕЛАРУСИ

 

ВАСИЛИЙ ДОКУЧАЕВ

 

ЗЕМЛЕДЕЛИЕ. ПОЧВОВЕДЕНИЕ. АГРОХИМИЯ