АЗОТОБАКТЕР

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

О МЕТОДИКЕ ОЦЕНКИ АЗОТФИКСИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ПОЧВ 

Под названием азотфиксирующей способности почвы, точнее азотфиксирующей способности микроорганизмов, ее населяющих, понимают способность почвы усваивать атмосферный азот за счет маннита, который вносят в испытываемую почву или прибавляют к заражаемой ею питательной среде.

Было предложено много методов для определения величины азотфиксирующей способности почв, но, с нашей точки зрения, ни один из них не может считаться удовлетворительным.

Первый метод определения усвоенного азота в жидкой среде состоит в том, что прибавляют 10% почвы к обычному питательному раствору с маннитом и затем после 15—30 дней стояния в термостате определяют в нем количество фиксированного азота.

Этот метод явно имеет много недостатков. Размножение азотобактера в жидкой среде замедляется вследствие недостаточной аэрации, конкуренции посторонних микробов и развития маслянокислого брожения, которое довольно часто обнаруживается в этих неблагоприятных условиях. Все это снижает прибыль азота и делает ее очень изменчивой и обычно слишком незначительной.

Следуя второму методу, прибавляют 1—2% маннита на 100—200 г почвы, которую выдерживают в термостате в наиболее благоприятных условиях увлажнения. Через 3—4 недели в небольшом количестве такой почвы определяют прибыль фиксированного азота. Недостаточно точный с аналитической точки зрения — так как непосредственно определенное небольшое количество азота должно перемножаться для получения окончательного результата на высокий коэффициент — этот метод не более оправдывает себя и с микробиологической стороны. Часть маннита в почве всегда пропадает для азотфиксаторов, перехватываемая другими микробами, особенно в почвах, в которых нет недостатка в связанном азоте. Вследствие этого количество фиксированного азота никогда точно не соответствует количеству разложенного маннита.

Третий метод заключается в определении азотфиксирующей способности почв по их способности разлагать маннит. Этот метод основан на исследованиях Кристенсена, который выработал специальный способ, позволяющий следить за разложением этого вещества в почве через каждые пять дней, учитывая в ней его наличие при помощи перманганата. Но применение этого метода к определению величины азотфиксации могло бы носить лишь произвольный характер. Соотношение между этими двумя процессами — азотфиксацией и разложением маннита — никогда не было точно установлено для почвы и это было даже невозможно при помощи упомянутых методов исследования. Более того, возражения, выдвинутые против предыдущего метода, сохраняют свою силу и в этом случае.

Резюмируя, надо сказать, что нам еще надлежит создать необходимую для исследования этого вопроса методику, которая позволила бы судить о присутствии или отсутствии азотобактера в почве, о его численности и о количестве азота, фиксированного им за счет маннита, которое могло бы служить мерилом его активности в соответствии с его развитием в почве.

В указанных целях мы решили воспользоваться твердой минеральной средой, лишенной каких-либо следов связанного азота, к которой прибавлялось бы определенное количество маннита. Для приготовления бактериологической среды подобного рода наиболее подходящим оказался желеобразный силикат или кремнекислый гель. Ниже указывается способ приготовления пластинок такого состава, которыми мы в настоящее время пользуемся.

Смешивают равные объемы соляной кислоты удельного веса 1,10 (13° Бомё) и раствора кремнекислого калия удельного веса 1,06 (6—8° Бомё), прибавляя силикат в кислоту при постоянном помешивании. Чтобы приготовить большие пластинки, разливают по 200 мл смеси в чашки Петри, диаметром 20 см, и оставляют их стоять строго горизонтально, до образования геля, что происходит через несколько часов.

Когда гель затвердеет, его промывают сначала проточной водопроводной водой» а затем кипящей дистиллированной, наливая ее по нескольку раз небольшими порциями в чашки Петри. Промывная вода под конец не должна давать реакпии на хлор. Для промывания пластинок указанной величины требуется 2—3 дня. Приготовленные из геля пластинки могут сохраняться очень долго, если их держать во влажной камере.

Чтобы пластинку из чистого геля превратить в питательную среду для развития микробов, ее пропитывают минеральным раствором следующего состава:

Фосфорнокислого калия, г 0,25

Сернокислого магния, г.     0,15

Хлористого натрия, г           0,15

Сернокислого железа          Следы

Сернокислого марганца      »

Дистиллированной воды, мл                      100

Наливают 20 мл этого раствора в маленькую колбочку, прибавляют 0,5 г углекислого кальция и 2 г маннита, нагревают до кипения и постепенно выливают на поверхность геля. Оставляют чашку открытой на металлической пластинке термостата Ру в течение нескольких часов до испарения жидкости. После этого чашка готова для посева, который производится непосредственно самой почвой.

Для этого приготовляют среднюю пробу просеянной почвы, берут из нее 1 г из расчета на абсолютно сухую почву и рассевают ее возможно равномернее по всей поверхности пластинки.

Засеянные таким образом пластинки выдерживают в термостате при температуре 30°.

В случае возделываемых плодородных почв более или менее многочисленные колонии азотобактера появляются через 2—3 дня; другие почвы дают редкие колонии, третьи—совсем ограниченное число, не более одного десятка; наконец, нередки случаи, когда роста на пластинках не наблюдается.

Вопрос об относительном количестве азотобактера в данной почве решается путем подсчета выросших на пластинках колоний. Не надо думать, однако, что полученные цифры точно соответствуют числу клеток азотобактера в почве. Колонии на геле вырастают не из одной клетки азотобактера, а из естественных колоний, состоящих из значительного скопления клеток микроба, что является обычной формой развития азотобактера в почве. Заметим также, что подсчет надо производить не позднее, чем через три дня после посева, так как, если колонии многочисленны, то они скоро начинают сливаться в участки, которые покрывают большую часть поверхности пластинки.

Микроскопический просмотр этих колоний показывает, что они неизменно состоят из азотобактера, чаще всего чистого, но иногда слегка загрязненного мелкими бактериальными формами. Нередко, однако, на этих пластинках с опозданием появляется Clostridium pastorianum, который никогда не дает обособленных колоний, но развивается в слизи, образуемой азотобактером, приподнимая ее выделяемыми им пузырьками газа. Последнее является верным признаком его развития. Глюкоза, употребляемая вместо маннита, благоприятствует самопроизвольному развитию этого анаэробного фиксатора азота на пластинках, однако и применение маннита не устраняет его.

Дней через восемь белая слизь колоний превращается в бурую корку, как бы приросшую к гелю, и после этого никаких изменений на пластинках не замечается. Они годны для химического анализа. Чтобы их к этому подготовить, их сушат в термостате при невысокой температуре. Через десять часов гель пластинок вместе со своим слизистым налетом превращается в несколько граммов бурого песка, который вносят в колбу Кьельдаля для определения в нем азота.

Определения количества фиксированного азота на пластинках, засеянных почвами, приблизительно одинаково богатыми азотобактером, дают прекрасно совпадающие цифры усвоения азота. Приводим количества азота, полученные на четырех пластинках, засеянных четырьмя образцами различных плодородных почв.

Пластинки, диаметром 20 см, засеянные 1 г почвы; маннита прибавлено 2 г; в термостате выдерживались 5 дней:

Чистая прибыль, мг

Почва I           21,2

» II      21,2

» III     21,6

» IV     22,1

Чтобы сравнить эти почвы с другими, менее богатыми азотобактером, необходимо определить минимальное время, требуемое для разложения определенного количества маннита, иначе пластинки с небольшим числом колоний, если их работу не ограничить известным сроком, точно так же могут довести продукцию аммиака до достаточно большой величины.

Так, например, почва луга дала только две колонии, почва леса только двенадцать, но через 20 дней стояния в термостате, несмотря на очевидную бедность этих почв клетками азотобактера, эти колонии превратились в сплошные участки слизи, покрывавшие до сотни квадратных сантиметров. Определения азота, произведенные через тот же срок, показали ощутительную прибыль его, хотя, правда, еще ниже цифр предыдущей серии опытов.

Таким образом, если надо сравнить азотфиксирующую способность различных почвенных образцов, необходимо установить продолжительность инкубации, с тем чтобы она не превосходила времени, необходимого для окисления маннита в опыте, принятом для сравнения за образец. Можно было убедиться, что в условиях нашего опыта для этого достаточно было 10 дней. Неактивные почвы не могут израсходовать в течение такого срока такое же количество маннита, что и приводит в этом случае к меньшей прибыли фиксированного азота.

Что касается почв, которые не образуют колоний азотобактера на пластинках, а дают начало лишь некоторому числу мелких посторонних колоний, не обнаруживающих тенденции к разрастанию, то такая почва не вызывает заметной фиксации азота.

Приводим два примера:

Пластинки, диаметром 20 см, засеянные 1 г почвы; маннита прибавлено 2 г; в термостате выдерживались 20 дней:

Чистая прибыль, мг

. . 0,4 . . 0,3

Почва V » VI

Таким образом, ничтожному количеству азотфиксаторов соответствует ничтожная способность почв к азотфиксации, добавим — в условиях полного аэробиоза.

Несмотря на то, что все упомянутые опыты дали, в сущности, одинаковые результаты, независимо от размеров пластинок, мы все же считаем нужным придерживаться больших пластинок, диаметром 20 см, в которые прибавляется 2 г маннита. Они представляют несомненное преимущество в том смысле, что позволяют высевать 1 г абсолютно сухой почвы, не- слишком густо при этом покрывая поверхность геля почвенными частицами.

Приготовленные и засеянные, как это было указано, пластинки выдерживаются в термостате 10 дней при температуре 30°. Плотность населения азотобактера определяется подсчетом колоний через три дня; для определения азота сушат гель до превращения его в песок при температуре 35—40°

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ