Вся электронная библиотека      Поиск по сайту

 

Виноградский. МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ

АЗОТОБАКТЕР

 

С.Н. Виноградский

С.Н. Виноградский

 

Смотрите также:

 

Биография Виноградского

 

Микробиология

 

Почва и почвообразование

 

Почвоведение. Типы почв

 

растения

 

Геоботаника

 

 Биографии биологов, почвоведов

Биографии почвоведов

 

Эволюция

 

Биология

 

Эволюция биосферы

 

Геология

геология

Основы геологии

 

Геолог Ферсман

 

Геохимия - химия земли

 

Гидрогеохимия. Химия воды

 

Минералогия

минералы

 

Химия почвы

 

Круговорот атомов в природе

 

Книги Докучаева

докучаев

 

Происхождение жизни

 

Вернадский. Биосфера

биосфера

 

ОПЫТЫ С КУЛЬТУРАМИ НА ПЛАСТИНКАХ

 

Изучая работу какого-либо прибора, надо остерегаться разбирать его механизмы,— эта очень банальная истина приложима к приборам и аппаратам всех родов, включая сюда и микробный аппарат азотфиксации в почве. Это означает, что работа с чистыми культурами не могла бы привести нас к цели. Но вместе с тем препятствия были бы слишком велики, если бы мы стали следить за действием подобного аппарата, экспериментируя с почвой в ее естественной обстановке. Почва является для этого слишком сложной и трудно контролируемой средой, особенно с химической точки зрения.

 

Следовательно, необходимо заставить действовать возбудителей различных процессов вне почвы, рассеивая их с частицами последней на элективную среду, где их развитие и их деятельность могли бы развернуться перед глазами наблюдателя и быть легко прослежены.

 

Кроме того, последний прием имеет неоспоримое преимущество, так как мы избегаем при этом каких-либо манипуляций, которые могли бы вызвать изменения характерных особенностей микроорганизмов. Специфические микробы начинают действовать в их естественном состоянии, между ними сохраняются их первоначальные численные соотношения и не изменяется их биологическое окружение.

 

Мы уже рекомендовали в наших предыдущих работах (см. часть шестую) обязательное применение твердой среды, приготовляемой на основе кремнекислого геля. Мы давали рецепт приготовления, равно как и способ употребления такой среды для изучения процесса азотфиксации.

 

Мы остановимся на описании вырастающих в этом случае микроорганизмов после заражения среды почвой.

 

Нам удалось вызвать появление видимых глазом колоний азотобактера на пластинках, приготовленных из исходной почвы: способ макроскопических самопроизвольных культур. Мы дадим, наконец, некоторые указания, касающиеся культивирования анаэробов на пластинках из кремнекислого геля.

 

Питательные пластинки из кремнекислого геля.

Способ приготовления геля, когда смешивают силикат с кислотой и подвергают затвердевшую пластинку длительному промыванию, кажется нам наиболее простым и наиболее практичным. Чтобы в дальнейшем превратить такую пластинку в среду для культивирования, ее пропитывают раствором солей следующего состава:

Фосфорнокислого ка лия одноосновного,- г

Сернокислого магния, г     

Хлористого натрия, г          

Сернокислого железа         

Сернокислого марганца     

0,5 0,3 0,3

Следы Следы 100

Дистиллированной воды, мл         

 

Величина рН такого раствора колеблется от 4,9 до 5,0. Ее доводят до 7,3—7,5, прибавляя несколько капель раствора поташа. Для тех же целей можно воспользоваться соответственным количеством двуосновного фосфата калия, который сразу дает нужную величину рН; но кислый одноосновной фосфат лучше кристаллизуется и его легче получить чистым. Кроме того, он не дает осадка в растворе.

 

К этому минеральному раствору перед употреблением прибавляют маннит, глюкозу или какие-либо другие энергетические вещества, а также тонкий порошок чистого мела.

 

Для пропитывания пластинки из кремнекислого геля в чашке Петри, диаметром 9 см, наливают 2 мл минерального раствора в маленькую колбочку (вместимость 60 мл, модель Фурно), прибавляют туда 0,5 г маннита (или другого углеродного питательного вещества) и 0,1—0,2 СаС03, капают 11 капель 2%-ного раствора поташа (если брался кислый фосфат); прибавляют немного дистиллированной воды, кипятят несколько минут и, помешивая, выливают кипящую жидкость на пластинку. После этого надо оставить открытую чашку Петри на металлической пластинке в сушильном шкафу Ру в течение нескольких часов до тех пор, пока жидкость не испарится. Высушивание прекращают, как только поверхность геля становится матовой и сухой, не допуская растрескивания пластинки, что сделало бы ее негодной для употребления.          f^-

 

Если нужно приготовить «большую пластинку» (чашка Петри в 20 см)}- которая требует 200 мл смеси силиката и соляной кислоты и гораздо более длительного промывания (2—3 дня), то берут 10 мл питательного раствора, 2 г маннита, от 0,5 до 0,7 г СаС03 и 0,8—0,9 мл 2%-ного раствора поташа; смешивают все вместе в маленькой колбочке, кипятят и кипящую жидкость выливают на поверхность пластинки.

 

Для количественных опытов с конечным определением азота маннит взвешивают в сухом виде и непосредственно распределяют по поверхности пластинки, где он растворяется, пропитывая гель. Лишь после этого пластинку заливают кипящим раствором солей, в котором размешан мел. Действуя таким образом, избегают необходимости ополаскивать колбу, и никакой кристаллизации маннита на вертикальных стенках чашки Петри после испарения жидкости не происходит.

 

Пластинки, диаметром в 9 см, служат для трех целей: 1) обнаружить азотобактера в почве; 2) получить общее впечатление о количестве микроба в почве; 3) выделить штаммы, которые дали начало самопроизвольным культурам в почве.

Пластинки обычно заражают комочками почвы, которые раскладывают правильными рядами, что позволяет с первого же взгляда учесть число проросших комочков.

 

Колонии азотобактера появляются обычно через 48 часов в виде водянистой белой или зеленоватой слизи, обволакивающей комочки почвы.

 Они отличаются однородным составом клеток, что характерно для биотипа; посторонние формы встречаются редко и не препятствуют ни в какой мере ни морфологическому, ни физиологическому изучению микроорганизма.

формы, из которых состоят различные колонии. Однородность клеток, взятых из одной колонии, не оставляет желать лучшего, тогда как между клетками из различных колоний наблюдается разница в смысле величины, формы, структуры; это заставляет предполагать, что они принадлежат к различным видам или расам.

 

 Таким образом, придерживаясь приведенных указаний, в том случае, если опыты проводятся в среде, лишенной связанного азота, мы имеем простой и быстрый способ обнаруживать аэробных азотфиксаторов в почве и немедленно получать достаточно чистые колонии этих микробов.

 

Отношение же числа проросших комочков почвы к непроросшим дает представление о плотности заселения почвы этим микроорганизмом. Так, в почвах, обильно содержащих азотобактера, из 100 комочков прорастают обычно 25—30; это число редко доходит до 50. Пока еще ни одна природная почва не дала нам 100%. Такой процент прорастания.комочков получается лишь, если в почву предварительно вносится маннит (52).

 

Меняя питательные вещества, вносимые в почву, можно вызвать рост различных форм азотобактера. Перевивая их затем на пластинки из кремнекислого геля, пропитанные теми же самыми питательными веществами, часто получают колонии, состоящие из тех же форм, которые можно снова перевить и очистить. Приводим несколько примеров.

1.         Вызывают развитие самопроизвольной культуры, прибавляя 0,5 г молочнокислого кальция к 50 г контрольной почвы. См. на 53 и 54 развитие в почве кокковидных клеток азотобактера, диаметром 1,5 JA, т. е. более чем средней величины. Перевивка на кремнекислый гель, пропитанный лактатом, приводит к образованию колоний, состоящих из сходной формы. См. фиг. 16 табл. XXVI.

2.         Самопроизвольная культура в почве, к которой прибавлен крахмал. Развитие большого диплококка величиной 3 р. хорошо инкапсулированного. Перевивка с комочков почвы на кремнекислый гель с крахмалом. Колонии того же крупного диплококка азотобактера. См. фиг. 17 и 18 табл. XXVII и объяснения к ним.

3.         Арабиноза вызывает довольно слабое развитие самопроизвольной культуры в почве. Замечается тенденция к образованию толстых капсул. То же самое наблюдается на кремнекислом геле с арабинозой. См. фиг. 19 табл. XXVII.

 

Для оценки приведенных данных остается решить, имеем ли мы здесь дело с изменениями, вызванными воздействием различных питательных веществ, или с чертами, закрепленными наследственностью, которые в большей или меньшей степени будут удерживаться при всех условиях.

 

Большие пластинки. Эти пластинки, диаметром 20 см, употребляются: 1) для определения числа клеток азотобактера в одном грамме почвы; 2) для определения количества фиксированного азота.

 

Такой размер пластинок был выбран по тем соображениям, что в этом случае возможно, не слишком густо засевая пластинку, распределить по ее поверхности 1 г почвы. Пользоваться меньшей навеской было бы нерационально, если мы хотим, чтобы эта минимальная проба представляла микробиологически весь участок исследуемои

почвы. Если >ко брать более значительное количество почвы, не употребляя больших чашек Петри (что сильно загрузило бы термостат), то это имело бы тот недостаток, что почва не только образовывала бы корку на поверхности пластинки, но и изменяла бы элективные свойства среды. Таким образом, мы остановились на одном грамме, растертой, просеянной почвы в пересчете на сухой вес.

 

Само собой разумеется, что надо принимать все меры к тому, чтобы это незначительное количество высеваемой почвы действительно представляло ту почву, которую изучают. Если есть возможность брать образец почвы на месте работы, то смешивают возможно большее количество небольших проб, взятых по всей поверхности изучаемого участка. Сразу после этого почву просевают через фламбированное сито. Просеянную почву собирают в большую фламбированную коробку, отделяют часть ее, граммов двадцать, для определения влажности и для посева и пропускают в последний раз через алюминиевое фламбированное сито с миллиметровыми отверстиями. Граммов десять почвы сушат при температуре 100° в течение двух часов; остальная почва в это время предохраняется от высыхания. После определения влажности из почвы берется один грамм для посева. Взвешивание производится быстро в маленькой фламбированной капсуле, снабженной носиком, после чего почву, пользуясь этим носиком, рассевают возможно равномернее по всей поверхности пластинки.

Пластинка представляет собой полностью элективную среду, если, конечно, для ее приготовления использовались чистые реактивы. Из всех почвенных микроорганизмов на ней могут развиться колонии лишь двух групп микробов: аэробных и анаэробных фиксаторов азота, а также олигонитрофильные или, лучше, олигозофильные микроорганизмы.

Иногда на пластинках наблюдается развитие палочки с округленными концами, длиной в 2—3 р и шириной около 1 [х, которая образует маленькие, круглые, выпуклые, прозрачные, блестящие колонии в виде полушарий, похожих на небольшие стеклянные пуговки. Слизь таких колощпЪ настолько прочна, что трудно отделить часть колонии для пересева, так как игла легче забирает всю колонию сразу. Размазывая, подсушивая и окрашивая колонию на предметном или покровном стекле, получают препараты палочек, расположенных параллельно, с большими промежутками между ними, среди бесструктурной массы, которая представляет собой слизь. Культивирование этой палочки не вызывает никаких трудностей при условии прибавления к манниту или глюкозе минимального количества аммиачного азота. Она была названа в нашей лаборатории «слизистой» палочкой — Bacille gommeux. Достаточно познакомиться с препаратами из колоний этого микроба, чтобы понять, чем обусловлена эта ограниченная потребность в азоте, так как колонии состоят из безазотистого вещества —слизи, в которой содержится лишь незначительное число палочек.

Роль описанной палочки сводится к использованию последних следов аммиачного или нитратного азота, и это объясняет их присутствие в среде, на которой должны развиться азотфиксаторы.

Что касается азотобактера, то колонии этого микроорганизма уже ясно заметны на пластинках после 48 часов стояния чашек Петри в термостате при температуре 28—30°. Такой срок считается достаточным, так что если к этому времени микроб еще не начинает развиваться, то весьма вероятно, что он не появится вовсе.

 

Макроскопические признаки колоний не всегда одинаковы. Можно достаточно ясно различить среди них три типа: 1) большая капля негустой слизи, слегка мутноватой; мы называем их жидкие колонии; 2) сухой рост — образуется как бы срастающаяся с гелем пленка, белая, морщинистая, немного напоминающая тонкий слой инея; это — сухие колонии; 3) выпуклые слизистые образования консистенции крахмального клейстера — выпуклые колонии. Все колонии состоят из типичных клеток азотобактера, но под микроскопом они дают различную картину. Так, на препаратах из жидких колоний встречаются диплококки или свободные удлиненные формы клеток, которые не образуют зооглей и расположены в негустой слизи (фиг. 14 и 15 табл. XXVI). Остальные два типа колоний состоят из густых масс кокков, соединенных в тетрады, группы и даже сарциноподобные пакеты (фиг. 12 и 13 табл. XXVI).

 

Не имея намерения долго останавливаться на морфологических деталях, мы все же считали необходимым дать краткие характеристики различных типов колоний, для того чтобы облегчить определение «микробиологического пейзажа», когда на них развиваются эти различные формы азотобактера. Однако последнее не всегда наблюдается. Иногда вырастают одни жидкие колонии: в этом случае пластинки усеяны большими каплями, почти водянистыми в молодом состоянии, но мутнеющими и уплотняющимися в дальнейшем. Их вид совершенно однообразен. Но очень часто те же самые жидкие колонии бывают перемешаны с сухими, которые в виде небольших «белых ковриков» размещаются между каплями. Такая комбинация встречается чаще всего. Иногда к этим колониям прибавляется третья форма в виде вздутых бугорков, но это наблюдается реже.

В течение 3-го и 4-го дня колонии быстро увеличиваются в размерах и сливаются в большие водянистые участки в случае жидких колоний; при развитии же сухих колоний образуются «белые коврики» большей величины, покрывающие сначала десятки, а позднее сотни квадратных сантиметров. В ат,о . . в р е мя (но никогда не раньше 4-го дня преб ы й-а ни' я в термостате) на сцену могут выступить анаэробные азотфикса- т о р ы.

В густой слизи появляются небольшие островки пузырьков, которые сохраняются, не лопаясь, и очень точно отмечают места размножения анаэробов. Эти островки очень быстро разрастаются и часов через десять могут захватить весь слой слизи или большую его часть. На препарате, приготовленном из одного из таких пузырьков, легко находят Clostridium, тесно перемешанный с азотобактером. Clostridium располагается в слизи не равномерно, а гнездами; часто наблюдается, что преобладает тот или другой из азотфиксаторов — азотобактер или Clostridium. Первый случай показан на фиг. 20 и 21, второй на фиг. 22 табл. XXVII (см. объяснение к ним).

К 5-му дню культура начинает стареть. Побурение, которое начинается с сухих колоний, быстро распространяется. Когда оно успевает захватить всю поверхность и когда в то же время пузырьки газа, если они имелись, оседают, можно с уверенностью считать, что питательное вещество потреблено и питательная среда полностью истощена. Тогда наступает время прервать опыт, так как культура начинает заселяться обычными формами палочек и плесенями.

В качестве преобладающих форм на пластинках развивались, как мы видели, аэробные фиксаторы азота. Если они отсутствовали в высеваемой почве, то пластинка оставалась почти или совершенно стерильной, и в ней не наблюдалось фиксации азота. Таким образом, указанным способом можно получить наиболее точный ответ на вопрос, присутствуют или отсутствуют клетки азотобактера в данном почвенном образце.

Что касается их количества в почве, то заметим, что число вырастающих на пластинках колоний не совпадает с числом клеток, содержащихся в грамме почвы, ввиду того что азотобактер в почве всегда находится в состоянии естественных колоний.

Разница в числе колоний, вырастающих при высеве образцов различных почв, иногда очень велика. «Активные почвы» в течение 48 часов покрывают почти всю поверхность пластинки без промежутков, что соответствует количеству колоний от 2 до 3 тысяч на пластинку или на 1 г почвы. С другими почвами число развивающихся колоний достигает лишь нескольких сотен. Наконец, нередко встречаются образцы почв, которые дают начало не более как нескольким десяткам колоний, цифра, которая иногда падает до нескольких или даже до одной колонии на пластинку. Таким образом, сравнительные подсчеты могут дать довольно ясные результаты, так что, пользуясь этим приемом и увеличивая число опытов, можно установить различные категории почв с точки зрения их богатства клетками азотобактера.

Что касается качественной разницы между клетками азотфиксаторов в почве, то она зависит, с одной стороны, от встречающихся в почве различных вариантов аэробных азотфиксаторов, о которых мы упоминали; с другой — от того, какое участие принимают анаэробы в процессе усвоения азота в почве.

Последнее находится в прямой связи с количеством их спор в почве, но только в том случае, если почва одновременно достаточно богата клетками азотобактера, для того чтобы выделяемая последними слизь была обильной и могла обеспечить достаточную защиту для анаэробов.

 

Пластинки для анаэробов. Чтобы заставить Clostridium развиваться самостоятельно, необходимо предохранить пластинки от воздействия кислорода. С этой целью лучше всего воспользоваться эксикаторами обычной формы, достаточно большими, чтобы поместить в них несколько чашек Петри, диаметром 15 см.

Чашки наполняют 200 мл силикатной смеси, пропитанной 2 г маннита или глюкозы. С пластинками обращаются так же, как с пластинками для аэробов, но слой геля делают большей толщины.

Посев производится почвой, высушенной при температуре 100° и растертой до пылеобразного состояния. Берут 1 г такой почвы и рассевают ее по поверхности пластинки. В эксикатор наливают 100 мл 12%-ной щелочи. На плоское блюдечко насыпают 10 г пирогалловой кислоты и спускают его в эксикатор так, чтобы оно плавало на поверхности щелочи. Опускают чашки Петри в эксикатор при помощи полос крепкой бумаги, закрывают крышкой, хорошо смазанной жиром, и начинают покачивать эксикатор, для того чтобы щелочь и пирогалловая кислота пришли в соприкосновение и образовалась бы смесь, поглощающая кислород. Абсолютной необходимости применять выкачивание воздуха при помощи насоса нет, но частичное разрежение давления до 40—50 см облегчает начало развития культуры. Надо остерегаться уменьшать его еще больше, чтобы не слишком понизить парциальное давление азота.

Обычно через три дня пребывания в термостате при температуре в 30° замечают первые пузырьки на поверхности геля, но хорошо выраженных колоний еще не наблюдается. Еще через несколько дней намечаются кар- манообразные скопления газа, которые углубляются в гель, доходя да дна чашкн Петри. Под конец вся толща геля пронизана — но не разрушена — этими чечевицеобразными продолговатыми карманами, наполненными газом. Рассматривая их, можно заметить, что их стенки покрыты каким-то веществом, которое утолщается по направлению ко дну чашки, где образуются беловатые скопления. Если вырезать эти карманчики и сделать из их стенок мазок, то в препарате обнаруживается микроскопически чистый Clostridium. Таким образом, это именно его колонии погружаются в гель, активно проникая внутрь него; движимые, видимо, своим отрицательным аэротропизмом, они укрываются здесь от следов кислорода, которые, может быть, еще сохраняются в соприкасающемся с ^пластинкой воздухе.

Культура может развиваться в таких условиях до исчезновения маннита или глюкозы, для чего требуется около 14 дней. Через каждые два дня из эксикатора выкачивают накопляющийся в нем газ, чтобы предотвратить повышение давления, которое могло бы приподнять крышку эксикатора или сделать его закупорку менее герметичной.

При помощи этого способа культивирования на пластинках в анаэробных условиях можно легко выделять штаммы анаэробных азотфиксаторов или Clostridium из различных почв. Мы не будем на этот раз останавливаться на их отличительных морфологических признаках. Представляя один и тот же цикл развития, они отличаются один от другого достаточно выраженными и постоянными особенностями. Мы это могли, по крайней мере, констатировать, изучая с этой точки зрения три образца из далеко отстоящих одна от другой местностей и сравнивая их между собой и с почвой, взятой в Бри (см. фиг. 9 и И табл. XXVI). Этими тремя образцами почв были: почва из Алжира (окрестности Бона), один образец тропической почвы из Сан-Джозе, Коста-Рика (см. Clostridium из этой почвы, фиг. 20 табл. XXVII) и почва из Техаса; Clostridium из этой почвы встречается между клетками азотобактера (фиг. 21 и 22 табл. XXVII).

 

Почвенные пластинки. Микроскопическое исследование самопроизвольных культур в почве подало мысль вызвать развитие тех же самых микробов в виде колоний, различимых невооруженным глазом, внося в почву усвояемый углерод без азота. Действительно, те же почвы, в которых происходило микроскопически улавливаемое размножение азотфиксаторов, оказались способными давать видимые колонии азотобактера на отполированных поверхностях почвенных пластинок, приготовляемых из этих почв после внесения в них энергетического вещества.

Для этой цели можно пользоваться теми же самыми соединениями, что и при выращивании самопроизвольных культур, но крахмал оказался наиболее пригодным. При внесении маннита или глюкозы брожение в почве начиналось слишком быстро, вследствие чего пластинки скоро вспучивались и растрескивались, что портило их гладкую поверхность и уничтожало появившиеся колонии.

Приготовление почвенных пластинок элементарно просто. Берут свежую почву, освобождают ее от мелких камешков, вносят 5% крахмала, прибавляют небольшими порциями воду и замешивают получившуюся массу до тех пор, пока она не станет пластичной, избегая избыточного количества воды. После этого почву вдавливают при помощи шпателя в чашку Петри диаметром 4—5 см, наполняя ее до краев; наконец, поверхность пластинки полируют предметным стеклом, смоченным в воде. Приготовленные таким образом пластинки сохраняют во влажной камере в термостате.

В том случае, если почва содержит клетки азотобактера, очень точно через 48 часов на поверхности пластинки обнаруживаются мелкие колонии, хорошо оформленные, достигающие 1—2 мм в диаметре. Некоторые из них прозрачные, другие беловатые, но оба типа колоний хорошо выделяются на бурой поверхности пластинки (53).

Микроскопируя те и и другие колонии, убеждаются, что они состоят из азотобактера, удивительно чистого для среды, столь богатой разнообразными микроорганизмами, как почва; достаточно сказать, что под микроскопом между однородными клетками азотобактера нельзя обнаружить никакого загрязнения. Это подтверждается фиг. 23 и 24, табл. XXVII, снятыми с препаратов наудачу.

В течение следующих дней колонии немного увеличиваются, расплываются и под конец покрывают поверхность почвенной пластинки бурыми пятнами, характерными для этих микробов. Это показано на 54.

Описываемый прием исследования значительно облегчает изучение процесса азотфиксации. Он делает это изучение доступным для всех тех, кто, интересуясь проблемой плодородия почв, не владеет микроскопической техникой.

Менее чувствительный, чем описанная выше микроскопическая методика, этот способ гораздо проще, когда надо убедиться в присутствии азотобактера в почве. Число колоний на пластинке дает общее представление об относительном количестве клеток микроорганизма в исследуемой почве.

Но не надо забывать того, что мы говорили относительно микроскопической методики, а именно, что отсутствие развития — в этом случае отсутствие колоний на поверхности почвенной пластинки — не указывает еще окончательно на отсутствие клеток азотобактера в почве; последние могут присутствовать, но не размножаться в исходной для них почве.

Контрольный высев такой почвы на кремнекислый элективный гель необходим, чтобы разрешить этот вопрос. Отсутствие колоний азотобактера и на этой последней среде снимает всякое сомнение относительно отсутствия клеток этого микроорганизма в почве. Если же колонии появятся, то исходя из того, что клетки азотобактера не развиваются в исходной для них почве, можно сделать вывод о непригодности последней для развития азотобактера, очевидно вследствие ее неспособности питать этот микроорганизм. Тогда возникает воспрос об удобрениях, необходимых, чтобы вернуть в этом смысле почве ее плодородие.

Возвращаясь к анаэробам при проведении наших исследований общего характера, мы старались применить к ним тот же самый метод самопроизвольных культур на почвенных пластинках. Clostridium энергично размножается на этих пластинках, что узнается по запаху, который они испускают; но, скрытые в почвенной массе, эти возбудители маслянокис- лого брожения не образуют хорошо видимых колоний.

Тогда нам пришла мысль, что колонии этих анаэробов должны хорошо развиваться в полостях, образующихся в пластичной массе почвенной пластинки вследствие давления выделяемого ими газа. Чтобы увеличить пластичность почвы, к ней прибавляют немного промытого очищенного каолина. Тогда густое тесто со внесенным в него маннитом или глюкозой утрачивает способность расплываться и на нем выступают маленькие бугороки, которые прикрывают хорошо очерченные полости, сообщающиеся между собой тонкими каналами. Вскрывая бугорки, можно различить простым глазом, но лучше при помощи лупы, маленькие белые колонии, расположенные на дне или на стенках полостей.

Микроскопический анализ показывает, что это колонии Clostridium без значительной примеси посторонних форм.

После некоторого усовершенствования описанный способ мог бы служить для получения самопроизвольных культур анаэробных азотфикса- торов в обстановке, похожей на естественную.

Более того, в свете этих данных начинает становиться понятным поведение анаэробов в почве, о чем до сих пор не имели никакого точного представления. Очевидно, что лишь одни эти микроорганизмы активны как азотфиксаторы при условии большой пластичности почвы, т. е. в почвах глинистых и сырых. Здесь они приобретают наиболее важное значение. Б^з их вмешательства энергетическое вещество в этих условиях было бы потеряно для азотфиксации, становясь при появлении каждой новой порции доступного азота в почве добычей обычных палочек. В почвах менее или совершенно непластичных главная роль снова переходит к аэробным формам, кроме периодов чрезмерного увлажнения, когда анаэробы конкурировали бы с ними из-за части энергетического вещества.

Способ выделения азотобактера и его чистые jK_y л ь т у р ы. Старая методика Бейеринка, которая состоит в том, что нескольких жидких, так называемых обогатительных культур выделяют микроорганизм на агаровых пластинках с маннйтом, оставляет желать многого в различных отношениях. Слишком часто, при пересевах из пробирки в пробирку, культуры, которые вначале кажутся чистыми, загрязняются различными формами, вследствие чего никогда нельзя гарантировать чистоту коллекционных штаммов азотобактера.

Причину такого неожиданного поведения культур, однако, нетрудно понять. Среда, лишенная азотного питания, может благоприятствовать развитию лишь азотобактера, в то время как бациллярные споры и клетки других микроорганизмов остаются в латентном состоянии. При повторных пересевах на пластинки они мало-помалу устраняются, но единичные экземпляры всегда могут сохраниться среди массы клеток азотобактера, причем невозможно подозревать их присутствие. В дальнейшем среда постепенно утрачивает свои элективные свойства и обогащается азотом за счет деятельности самого же азотобактера; тогда делается возможным развитие подобных микроорганизмов, которые начинают размножаться и загрязняют «чистую культуру». Это происходит по истечении более или менее длительного срока, по причинам, не поддающимся контролю.

Интересно, что это обычное, но плохо понятое явление послужило отправной точкой для одной экстравагантной теории, лишенной какой- либо экспериментальной базы. По этой теории азотобактер и вообще все бактериальные виды проходят чрезвычайно сложный цикл развития, в который входят палочковидные формы, нитевидные, спорогенные и еще многие другие, пока еще и не подозреваемые г.

Следующий способ дал нам наилучшие результаты:

1.         Самопроизвольные культуры на почвенных пластинках с крахмалом.

2.         Через 48 часов перевивка видимых колоний на другую почвенную пластинку. Если колонии еще малы, то пользуются препаровальной лупой и материал берут стеклянной палочкой, конец которой вытянут в волосок. Взятое количество разводят в 5—10 мл прокипяченного маннитного раствора и проводят несколько широких штрихов по поверхности почвенной пластинки. Такую пластинку приготовляют, замешивая почву с 2%-ным

1 L о е n i s. Studies upon the life cycles of the bacteria. «Memoirs of the National Academy of Sciences», 16. 250 p., 41 pi., Washington, 1У21.

раствором маннита и 0,1—0,2%-ным раствором фосфата калия. Стерилизуют при 120° в течение 20 минут. Культуры развиваются без замедления и имеют очень характерный вид (55).

3. Для чистых культур пользуются пробирками, длиной 10 см и диаметром 3 см , с плоским дном; в пробирки при помощи шпателя вносится слой почвы, замешанный в виде теста, после чего их стерилизуют при 120°.

Мы предпочитаем этот способ культивирования обычному на агаре. В таких условиях микроб прекрасно сохраняется и не изменяет своих свойств. Культуры высыхают, что благоприятствует их сохранению, так как хранение в сухом виде предохраняет от запоздалого развития бацилл. Соскобленные черные корочки годны для перевивки почти неограниченно долгое время.

 

 

 

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ

 

 

Последние добавления:

 

Ферсман. Химия Земли и Космоса

 

Перельман. Биокосные системы Земли

 

БИОЛОГИЯ ПОЧВ

 

Вильямс. Травопольная система земледелия

 

История русского почвоведения

 

Качинский - Жизнь и свойства почвы

 

Вернадский - ЖИВОЕ ВЕЩЕСТВО