АЗОТОБАКТЕР

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

ПРОИСХОЖДЕНИЕ АММИАКА ВЫДЕЛЯЕМОГО ФИКСАТОРАМИ АЗОТА

Прежде чем начать обзор исследований, касающихся одной из самых спорных проблем в области микробиологии, полезно вспомнить, что изучение аэробных азотфиксаторов претерпевает в настоящее время своего рода кризис. Старые рецепты сред и старые методы, применявшиеся в течение тридцати лет, во многих отношениях были ошибочными, новые же еще не стали общепринятыми. Особенно в области морфологии можно констатировать настоящую путаницу, главная причина которой должна быть приписана теории жизненных циклов Лёниса. Если правильно, что азотобактер, развиваясь, проходит в определенной последовательности через несколько стадий, образующих цикл его развития, то его мнимый хаотический плеоморфизм основан исключительно на ошибочных наблюдениях. Уже десять лет назад (Очерки по почвенной микробиологии, 2-я статья, 1926, стр. 500) мы определили главную причину этих ошибок, которая кроется в запоздалом развитии загрязняющих микроорганизмов, упорно сохраняющихся в «чистых» культурах азотобактера.

Имея давность около 70 лет, идеи плеоморфистов представляют собой последовательный ряд недоразумений, которые являются плодом грубых ошибок и произвольных толкований. При проведении подобных исследований совершенно необходимо постоянно пользоваться микроскопическим контролем, и только в этом случае можно быть уверенным, что развитие специфического микроорганизма действительно происходит в отсутствие каких-либо посторонних примесей. Для того чтобы такой контроль был эффективным, очевидно, необходимо в совершенстве знать морфологию изучаемого микроба. После волнений, внесенных теориями плеоморфистов, утверждение, что работа производилась лишь с чистыми культурами, понятно, не следует понимать буквально. Очень часто такое утверждение представляет лишь личное мнение работающего или выражает его доверие к этикетке коллекционной культуры. Последнее нередко наблюдается среди биохимиков, у которых обычно нет свободного времени самим заниматься микроскопической техникой.

Спутники азотобактера всегда развиваются очень медленно, не слишком препятствуя его размножению, и последний сохраняет свои макроскопические особенности в течение бесконечного числа перевивок. Но такое относительное благополучие прекращается, как только среда получает азотное питание. Равновесие тогда нарушается в ущерб азотобактеру, который после этого не ответственен более за процессы, развивающиеся н среде. В дальнейшем станут ясными причины, по которым мы начинаем наш обзор с этих замечаний.

Известно, что мы обязаны Костычеву [1] оживлением старой идеи, внушенной ему синтезом Габера, которая ставила синтез аммиака из Na и Н2 в основу круговорота органического азота на земле. Могла ли подобная же реакция происходить в культурах азотобактера при помощи органических катализаторов? Искомым для этого доказательством могло бы служить присутствие аммиака в культурах микроорганизма.

Культивируя коллекционные штаммы азотобактера в питательной среде с глюкозой, Костычев и сотрудники обнаружили в ней через 10—15 дней инкубации заметные количества аммиачного азота, который они, не колеблясь, признали за первичный продукт фиксации. Более того, в той же среде они нашли аминный азот почти в тех же количествах, что аммиачный. Но проведенные наблюдения не были достаточны, для того чтобы подтвердить вывод, сделанный этими авторами: накопление аммиака и особенно аминокислот в окружающей среде может с таким же успехом вызываться процессом автолитического дезаминирования клеток азотобактера, не говоря уже о возможной деятельности посторонних микроорганизмов, присутствие которых не исключено при работе с культурой, предварительно не подвергнутой тщательному просмотру. О подобном контроле в статье авторов не упоминается.

В общем, заслугой указанной работы была отчетливая постановка вопроса, но в ней не было приведено достоверных фактов в пользу биогенного синтеза аммиака. Работа вызвала в России ряд последующих исследований и обсуждений; Миненков, Димиденко и др. получили лишь отрицательные результаты, некоторым другим авторам удавалось уловить только минимальные количества аммиака от 0,001 до 0,01 мг. На этом изучение проблемы остановилось.

С. Виноградский снова заинтересовался этим вопросом в 1929 г. [3] под влиянием одного совершенно неожиданного наблюдения. Пластинки кремнекислого геля, пропитанные органической солью натрия и с о в е р- шенно лишенные азота, начинали выделять аммиак тотчас же, как только их поверхность покрывалась колониями азотобактера, т. е. на 2—3-й день. Это выделение усиливалось вследствие изменения рН среды, величина которого быстро возрастала от начальной, равнявшейся 7,0, почти до 9,0. Таким образом, было более чем вероятным приписать увеличение выделения аммиака резкому поднятию щелочности в среде, содержащей в качестве питательного вещества только органическую соль натрия.

Правда, щелочность не является единственным условием для выделения аммиака [5]. Оно наблюдалось на пластинках с этиловым спиртом, где величина рН не достигала 8,0. Но в этом случае выделение запаздывало,, совпадая со временем исчезновения энергетического вещества. Является ли на этот раз выделяемый аммиак продуктом дезаминирования клеточного вещества? Нет ничего менее доказанного, так как 1) тщательный просмотр микробного населения пластинок не обнаруживает в это время никаких явлений автолиза, 2) загрязнения не наблюдается.

Остается еще упомянуть последнюю работу Костычева и сотрудников [4], которая была напечатана в промежутке между опубликованием двух статей Виноградского. Надо отдать ему справедливость, что на этот раз аммиак, который выделялся у него на пластинках из кремнекислого геля,, приготовленных нашим методом и стоявших в термостате в течение 2 3, дней, действительно мог быть синтезированным аммиаком. Количество его было гораздо меньше, и не было больше вопроса об аминокислотах, слишком характерных для процесса разложения белков.

Что касается аммиака, выделяющегося на поздних стадиях, то он, по мнению Костычева, является продуктом дезаминирования в результате жизнедеятельности микроба.

Взгляды Виноградского и Костычева встретили решительного противника в лице Бэрка, ученого, который, как известно, специально занимался изучением фиксации азота. Он не был склонен принимать точку зрения указанных авторов, так как ему не удалось обнаружить ни аммиака, ни -какого-нибудь другого растворимого соединения азота в течение его продолжительных опытов [2] со штаммом Az. chroococcum. Это «отсутствие выделения растворимых азотсодержащих веществ», в первую очередь аммиака, показывает, что развитие микроорганизма идет параллельно с фиксацией, «будучи ею ограниченным». Если клетка обладает специальной энзиматической системой, роль которой состоит в том, чтобы служить катализатором при переходе молекулярного азота в азот фиксированный, то эта система должна быть «связана с ростом», т. е. быть нераздельно связанной с протоплазматическим синтезом [7]. Таким образом, азотистые соединения превратились бы в клетке в белки и не стали бы легко выделяться клеткой в среду. Эта энзиматическая система получает название азотазы. Нитрогеназа, специфический энзим, соединяющийся прямо с N2, составляет ее часть. Обширное физико-химическое исследование посвящено их возможной кинетике, а экспериментальных доказательств их реального существования не приводится.

Первое сообщение на тему этого обзора было сделано этим автором на конгрессе в Оксфорде в 1935 г. [9]. Факт образования аммиака на этот раз признается. Но гипотеза о прямой фиксации N2 в форме NH3 в качестве первого этапа, хотя и «простая и привлекательная», была основана лишь на данных качественного характера и ей недоставало количественных доказательств. Подробное изучение разнообразных условий, действующих на образование NH3, привело бы к совершенно другим результатам, •которые коротко изложены.

За сообщением последовала статья [13], в которой были приведены все детали длинной серии опытов по этому вопросу. Так, например, было поставлено 300 культур и сделано 500 определений по Варбургу; были применены две методики, но главным образом методика микроманометрическая.

Вопрос был поставлен ясно: узнать, выделяется ли аммиак раньше, чем он перейдет в клеточный азот, согласно данным Виноградского и Костычева, или после протоплазматического синтеза.

Начиная с первых опытов, оказалось, что все культуры легко выделяют аммиак, количество которого достигает значительного процента общего азота.

Замена воздуха водородом не оказывала никакого влияния на выделение аммиака.

Если начинали следить за ходом его выделения, то бросался в глаза тот факт, что оно начиналось не раньше, чем количество углеродного питания снижалось до очень низкого уровня (0,003 °/0); выделение летучей щелочи не происходило до тех пор, пока питательное вещество (сахар) не становилось дефицитным.

Вследствие того, что наблюдалось дезаминирование самого клеточного вещества, рекомендовалось вести исследование в аппарате Варбурга без каких-либо питательных веществ. Следуя этой технике, в большинстве опытов пользовались густой суспензией клеток азотобактера, отцентри- фугированных, два раза промытых, снова отцентрифугированных, помещенных в раствор минеральных солей или просто в дистиллированную воду и сохраняемых иногда месяцы в леднике.

В этих условиях из клеток могло быть получено значительное количество аммиака в результате их «самопроизвольного разложения». Процесс аммонификации начинался немедленно, без периода инкубации и развивался по логарифмической кривой как в аэробных, так и в анаэробных условиях. В отсутствие энергетического материала, при благоприятных условиях (рН, температура) в аэробных условиях выделялось максимально до 50% общего азота клеток, а в анаэробных — до 10%.

Исследования дыхания показали, что аэробное выделение аммиака точно соответствует окислению вещества клеток. Определения их сухого веса показывали, что образование аммиака сопровождалось потерей вещества таким образом, что, когда выделение аммиака достигало максимума в 50%, исчезала половина клеточного вещества. Процесс имел ясный характер хорошо известного окислительного дезаминирования в присутствии воздуха. А в анаэробных условиях? Этот вопрос получил лишь гипотетический ответ.

Приведем, наконец, еще одно наблюдение Бэрка, не менее неожиданное, чем столь интенсивное самопроизвольное разложение! Кратко изложенное петитом, оно касается действия пастеризации. Нагревание до 75° и да*ке до 95° в течение 30 минут приостанавливает аммонификацию, но лишь на время. Через 10—15 часов она снова начинается и достигает первоначального уровня. «Не связанная с жизнью, строго энзиматическая природа процесса ясна» (стр. 111).

Пропуская критику деталей в опытах Виноградского и Костычева, мы доходим до общего заключения автора, сформулированного таким образом: «Внеклеточный аммиак, обнаруживаемый до настоящего времени в наших собственных исследованиях и в предшествовавших нам работах, появляется, по всей вероятности, в результате разложения связанного клеточного азота.... но непрямого синтеза из N2» (стр. 120).

«Тайна промежуточного каталитического процесса остается попрежнему не разрешенной».

Разберем подробнее приведенные опыты и заключение. Почти излишне говорить, что природа процесса, изучавшегося Бэрком и Хорнером, не возбуждает никаких сомнений — здесь дело касается простого дезаминирования. Но почему оно возникает? Действительно ли оно происходит в результате автолиза клеток, физиологические особенности которых еще До сих пор остаются так плохо изученными?

В этом вопросе нам поможет разобраться критика состояния наших знаний по группе азотобактера, изложенная в предисловии к настоящему обзору. Она поможет нам разобраться в многочисленных данных указанных выше авторов.

Были ли культуры азотобактера, использованные в их опытах, абсолютно свободны от посторонних бактериальных зародышей в латентном состоянии, которые так часто встречаются в «чистых» культурах этого микроорганизма? Авторы ничего не говорят об этом. Такого подозрения у них не возникало. Они отмечают лишь, что пластинки засевались культурой Az. vinelandii с зеленым пигментом и Az. chroococcum с бурой пигментацией. Чаще всего употреблялась первая культура — штамм, в течение двадцати лет хранившийся в лаборатории. Отсюда следует, что

экспериментаторы не подвергали свои «чистые» культуры никакому контролю. Таким образом, наши сомнения полностью оправдываются. Более того, они способствуют пониманию описанных экспериментальных данных иначе в достаточной мере загадочных и противоречивых.

Начав с логарифмических кривых, которые должны изображать ход автолитического разложения, отметим, что они поражают своим неправдоподобием. В самом деле, в случае истинного автолиза клеток азотобактера явление развивается чрезвычайно медленно. Следя за действительно чистыми культурами из недели в неделю, не замечают в них никаких изменений и лишь к концу нескольких недель в них появляется заметное количество автолизированных клеток, однако на фоне преобладающей массы клеток нормального вида, с неизменившейся способностью к окрашиванию. Трудно предположить, чтобы эти самые клетки, внесенные в сосудик аппарата Варбурга, могли сразу же начать выделять аммиак, теряя через 100 часов половину своего азота. Но все становится ясным, как только мы допустим в данном случае вмешательство посторонних аммонифи- каторов: нарисованные кривые прекрасно отражают первый период деятельности каждого обычного бактериального возбудителя процесса а ммо нифика ций.

Становится также понятным, что продукция аммиака продолжается в атмосфере водорода.

Ясно, что окислительное дезаминирование вызывается деятельностью посторонних бактерий.

Анаэробная аммонификация более не удивляет, так как споры анаэробных бактерий редко отсутствуют в культурах, выделенных при помощи обычного метода обогащения.

Наконец, действие пастеризации, которая вызвала дезаминирование, «не связанное с жизнью», не нуждается более в гипотезах для своего объяснения, будучи сведенным к самому обычному явлению. Очевидно, пастеризации было недостаточно для уничтожения всех зародышей микроорганизмов, особенно спор, которые через 10—15 часов (указанный срок) вновь начинают развиваться в культуре.

В общем, эксперименты цитированных авторов касались лишь самого обычного явления разложения клеток азотобактера, и совершенно ясно, что их масса, центрифугированная, промытая и превращенная во взвесь в растворе солей или в дистиллированной воде — в качестве инертной материи, не могла оказать никакого сопротивления аммонифицирующим микробам. Хранение в холодильнике при температуре в 5° было недостаточным, чтобы прекратить всякую деятельность бактерий и, возможно, что она наблюдалась уже с самого начала опытов, чем объясняется отсутствие инкубационного периода.

Возможно, что большое и трудолюбивое исследование авторов заставило бы поколебаться высказать такое мнение, если бы другие доводы решающего характера не подтверждали его. Это касается противоречий и непостоянства в поведении азотобактера как в качестве бактерии, выделяющей аммиак в среде, лишенной связанного азота, так и в качестве аммони- фикатора органического азота.

Бэрк сам дал поучительный пример этого. В 1930 г. он настаивает на полном отсутствии аммиака в его культурах, перечисляя в подробностях все опыты, которые он делал, чтобы открыть его. «Было исследовано более 200 культур... с полностью отрицательными результатами» [2, стр. 1180]. Совершенно противоположно, как можно было видеть, поведение его последних культур. Тем не менее опыты касались одного и того же вида азотобактера и, вероятно, даже одних и тех же штаммов.

Еще более сомнительны, в общем, данные, касающиеся аммонифицирующей способности азотобактера по отношению к белковому азоту, а также аминному и амидному. Так, Костычев высказал по этому поводу два диаметрально противоположные мнения. В одном из них он утверждает, что микроб не является дезаминирующим организмом \ так как он не производит аммиака в присутствии пептона, в другом, — что азотобактер энергичный возбудитель дезаминирования  . Противоречия такого рода, в общем, служат верным признаком того, что дело касается меняющейся смеси бактерий, деятельность которых или суммируется или, наоборот, взаимно тормозится.

Бэрк и Хорнер подробно занимались этим вопросом в разбираемой нами работе. Они приходят к выводу, что азотобактер способен частично или полностью дезаминировать большое число соединений азота — как то белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, амиды простые и замещенные — тем же путем и в таких же количествах, как он это делает за счет собственного клеточного азота. Что касается газообразной фазы, рН, действия наркотиков, то отношение к ним аналогично. Эти факты, заключают авторы, основательно подкрепляют результаты их работы.

Несомненно, это было бы так, если бы сами факты оказались точными. Но этого нет.

Предваряя наше следующее сообщение, мы можем уже теперь утверждать, что азотобактер, подвергающийся систематическому очищению, которое все время проверяется, оказывается неспособным аммонифицировать пептон, аспарагин, бульон; этого совершенно достаточно, чтобы установить его неспособность к сколько-нибудь значительному дезаминированию. С пептоном той марки, которая употреблялась для опытов, он дает легкое помутнение, быстро исчезающее, растворы же аспарагина и бульон остаются прозрачными неопределенно долгое время. Через тридцать дней, заражая эти растворы, содержащие неактивные клетки азотобактера, проверенными микробами-аммонифика- торами, получают то же количество аммиачного азота, как в тех же самых растворах, свежеприготовленных. Эти опыты были проведены с зеленым флуоресцирующим азотобактером, очень энергичным, только что выделенным штаммом, обладавшим всеми отличительными особенностями Az. vinelandii, происходящим из Нью-Джерси. Эти культуры были любезно предоставлены в наше распоряжение Ваксманом и Бэрком.

Важность приведенного отрицательного аргумента ни от кого не может ускользнуть. Действительно, если азотобактер неспособен оказывать де- заминирующее действие на наиболее легко разлагающиеся азотистые вещества, то вряд ли можно приписать выделение аммиака в его культурах этому процессу, по крайней мере в таких больших количествах. Если в результате автолиза клеток и могут выделяться следы аммиака, то это все же не разрешает вопроса. Во всяком случае, надо признать ошибочным происхождение, приписываемое Бэрком и Хорнером аммиаку, определяемому в их опытах .

Бэрк воздерживается отрицать возможность биологического синтеза аммиака, но он настаивает на том, что его надо еще доказать. Без сомнения, в этой области остается еще многое сделать, но уже и теперь можно утверждать, что из всех теорий, выдвинутых по этому вопросу, последняя является наиболее вероятной, и это единственная теория, которая опирается на точные и легко воспроизводимые факты.

В своем сообщении, сделанном на Интернациональном микробиологическом конгрессе, Бэрк [14] убеждает исследователей механизма азотфиксации «строго придерживаться логики», чтобы избежать многочисленных ловушек, которые стоят на их пути. Он обращает их внимание на критерии, которые их предостерегут против ошибок и недоразумений. Таких критериев семь. Мы предлагаем восьмой, или, вернее, мы предлагаем правило, знать которое нам представляется особенно важным: остерегаться «чистых» культур и употреблять для опытов по механизму азотфиксации лишь культуры, неспособные аммонифицировать пептон, аспарагин и бульон.

Перейдем к работам Макса Роберга «К вопросу о биологии азотобактера» [10, 11, 12].

Первая из этих трех статей касается вопроса о фильтрующихся культурах азотобактера. Лёнис, Мие, де Регель нашли фильтрующиеся формы у азотобактера, которые являются своего рода «гонидиями», способными к воспроизведению нормальных вегетативных клеток. Чтобы проверить этот вывод, Роберг проводит большое число (271) очень тщательных опытов по фильтрации через фарфоровые свечи, фильтры Беркефель- да, Зейтца, мембранные фильтры и целлафильтры. Он приходит к заключению, что культуры азотобактера не проходят ни через один из названных фильтров при условии, что размер их пор не превосходит 0,3—0,75 Если же пользоваться фильтрами с порами большей величины, то часть опытов, однако всегда ограниченная, даст положительный результат, причем число таких утвердительных опытов повышается в соответствии с величиной пор. О «гонидиях» автор ничего не упоминает.

Добавим, что так называемые положительные случаи, именно в опытах Мессиневой (Микробиология, т. III, 1934, стр. 470—484), когда этот автор получил мельчайшие формы, способные культивироваться, совершенно отличные от азотобактера по своим морфологическим и физиологическим особенностям, хорошо объясняются небольшим загрязнением культур обычными спутниками азотобактера, о чем уже упоминалось раньше. Краткое описание этого явления, даваемое авторами, вполне соответствует характеру этого загрязнения.

Вторая статья Роберга затрагивает нашу тему ближе. Роберг ставит уже много раз до него исследовавшийся различными авторами вопрос о том, выделяет ли азотобактер в окружающую среду часть фиксированного им азота, который мог бы служить питательным веществом для почвенной микрофлоры, так же как и для высших растений.

Для этой цели культура микроба выращивается в 100 см3 питательно» среды с глюкозой или маннитом в термостате в течение срока от 2 до 87 дней. После этого в ней определяют общее количество фиксированного азота; фильтруют, чтобы получить фильтрат, совершенно свободный от клеток азотобактера, что строго контролируется пробами ad hoc,, и, наконец, в фильтрате определяется общий и аммиачный азот.

Цифровые таблицы позволяют сделать следующее заключение: 1) азот начинает выделяться в фильтрате через 2—15 дней, и количества его выражаются цифрами от половины до полутора миллиграммов на культуру; 2) это количество увеличивается в соответствии с увеличением продолжительности культивирования и может достигнуть 10—50% всего фиксированного азота, но лишь после 40—80 дней пребывания в термостате; 3) до тех пор, пока в жидкости имеются глюкоза или маннит, в ней не находят аммиачного азота, который появляется лишь после истощения энергетического вещества.

Роберг, видимо, удовлетворен полным совпадением этих результатов с данными Бэрка, но надо заметить, что такое же полное совпадение у него наблюдается и с данными Виноградского, который настаивал на отсутствии раннего выделения аммиака на пластинках с маннитом. и глюкозой [5, стр. 18, 19, 30].

С другой стороны, исследованиями Роберга никоим образом не могли подтверждаться данные Бэрка. Для того чтобы в этом убедиться, достаточно сравнить определения азота, приведенные в работах этих двух авторов Опыты Роберга продолжаются от 40 до 80 дней. За это время количество общего азота в фильтратах достигает в среднем 20 %— в виде исключения 50% — общего азота, фиксированного культурой, но аммиачный ^азот в фильтратах составляет не более 10% общего азота. В опытах же Б&рка, которые продолжаются только 100 часов, количество аммиачного азота доходит до 50% общего азота. Совершенно очевидно, что такое огромное расхождение не позволяет приписать эти два явления одному и тому же фактору. Если в работе Роберга, все время подчеркивающего применение тщательного микроскопического контроля к его культурам, вполне можно признать наличие процесса автолиза, то процесс, изучавшийся Бэрком, можно объяснить лишь присутствием посторонних примесей в культурах.

Третья статья [12] посвящена исследованию энзима, который может служить катализатором при фиксации азота вне клеток азотобактера. Здесь имеются в виду опыты Баха и сотрудников .

Роберг поставил себе целью попробовать воспроизвести эти опыты или,, по крайней мере, обнаружить в жидких культурах какое-либо растворимое начало, при помощи которого можно получить прибыль фиксированного азота.

Семидневные культуры были профильтрованы, чтобы надежно освободиться от присутствия микробных тел, и полученные фильтраты, после- определения в них общего азота, хранились в термостате в течение 60 дней. Вторичное определение не дало никакой прибыли азота.

Далее клеточную массу растирали с кварцевым песком. Вносили ее в раствор с сахаром, фильтровали и «сок» сохраняли в термостате также 60 дней. Никакой прибыли азота не обнаруживалось.

Тот же результат получался при разрушении клеток ультрафиолетовыми лучами или при нагревании до 60—70°. Наблюдалась лишь небольшая потеря азота после продолжительной инкубации.

Наконец, в двух опытах применение микропресса позволило точнее воспроизвести методику Баха и сотрудников [6]. Осадок, полученный в;

результате центрифугирования культур из десяти колб Фернбаха, а также слизь, собранная с поверхности больших чашек Петри (число их не указано) и растертая с песком, были подвергнуты давлению в 300 и даже 500 атмосфер. Попрежнему «сок» оказывался совершенно неактивным. Автор приходит к выводу, что фиксация молекулярного азота азотобактером связана с его жизнью и представляет собой жизненное явление, а не энзиматическое.

Симбиотическая фиксация азота привлекала еще больше исследований чем фиксация, осуществляемая азотобактером. Однако ее механизм оставался еще более неясным за отсутствием наблюдений, в достаточной мере показательных, для того чтобы они могли служить отправным пунктом для какой-либо теории.

Приступая к разрешению этой проблемы, казалось вероятным допустить известную аналогию между обоими случаями в смысле механизма фиксации. При исследовании симбиотической азотфиксации надлежало выяснить, возможно ли в этом случае выделение аммиака в условиях, которые указывали бы на его образование в качестве продукта синтеза, а не распада. Результаты первых положительных опытов в этом направлении послужили темой нашего доклада в Академии Наук [17].

Те же исследования подробно описаны в статье 1936 г. [19]. Последняя начинается с изложения опытов по вопросу о том, способны ли клубеньковые бактерии вне растения к азотфиксации в такой же мере, как азотобактер. Для проведения этого исследования был применен метод, еще нигде до этого не опубликованный: маленькие пластинки из кремнекислого геля с глюкозой, в которые прибавлялись постепенно повышающиеся небольшие дозы азота, аммиачного, нитратного, аминного или органического, выдерживались в термостате лишь в течение 4—6 дней, после чего в них определялся азот по микрометоду Кьельдаля. Многочисленные опыты дали отрицательный результат. Если некоторые следы прибыли азота и обнаруживались, то все же эта прибыль была слишком мала и непостоянна, чтобы делать вывод об азотфиксирующей способности культур клубеньковых бактерий вне растения. Параллельно с этим никакого выделения аммиака в чистых культурах этих микроорганизмов не обнаруживалось.

Этот отрицательный результат привел к мысли постараться обнаружить очаги выделения аммиака в тех же очагах, в которых происходит сама фиксация азота, т. е. в клубеньках. Идея оказалась плодотворной. С первых же опытов можно было убедиться в постоянном присутствии аммиака внутри клубеньков. Для этого надо было только отделить от корешков гороха несколько граммов клубеньков и разложить их по дну маленькой чашки Петри, к внутренней стороне крышки которой была прикреплена полоска лакмусовой бумаги. Эта полоска сразу начинала синеть, причем это происходило быстрее, если чашку помещали на пластинку, нагреваемую до 40°.

Отделенные от стебля корни гороха с находящимися на них клубеньками, тотчас же помещенные в промывные склянки, соединенные с поглотителями, наполненными подкисленной водой, выделяли значительное количество аммиака, улавливаемого поглотителями. В течение первых двадцати четырех часов выделение аммиака обычно было очень слабое, но, продолжая продувание сухого воздуха (что предупреждает развитие плесеней), можно было собрать за этот срок несколько десятков миллиграммов аммиачного азота, выделенного корнями свежего гороха, на которых имелись клубеньки. Вес их колебался от 60 до 100 г.

Корни же, с которых клубеньки были тщательно удалены, совершенно не выделяли аммиака. В равной мере это относилось к корням кукурузы, взятым в качестве контроля.

Выделение аммиака изолированными клубеньками происходит в течение длительного времени. Его можно воспроизводить в продолжение многих месяцев при условии, если хорошо просушивать клубеньки после каждого опыта. Полное высушивание при 40° останавливает выделение аммиака, по оно снова начинается после легкого увлажнения.

Вызвать выделение аммиака еще легче, если растереть клубеньки в мельчайший порошок. Этот порошок также пригоден для бесчисленного количества опытов при том же самом условии — сохранять его сухим в промежутках между ними.

Описанные наблюдения как будто указывают на то, что в данном случае действует энзим. Но обязан ли получающийся продукт — аммиак своим происхождением процессу дезаминирования или фиксации атмосферного азота?

Прежде всего представляет ли собой это выделение аммиака ненормальное явление, вызванное повреждением растения, или дело касается явления нормального, которое удалось уловить вследствие этого повреждения. Интересные работы Виртанена и фон Гаузена [18], хоть и косвенно, но касаются этого вопроса. Их опыты проводились с культурами гороха в стерильном песке с внесенными в него специфическими клубеньковыми бактериями, поливавшемся растворами солей. В различные периоды вегетации Определяли азот в наземных частях растения и в корнях, а также в песке. Неизменно во всех трех проведенных опытах наблюдалось обогащение песка азотом в результате роста растения, снабженного клубеньками, и, очевидно, за счет последних. Эта прибыль азота была настолько значительной, что песок в течение всех трех периодов вегетации содержал количества азота, в сущности равные его содержанию в выраставших на таком песке растениях.

Виртанен и фон Гаузен пришли к выводу о «выделении» азота растением с клубеньками. Что же касается природы этого азота, то они думают, что это аминный азот, и высказывают мнение, что аминокислоты, о которых идет речь, «получаются прямым синтезом во время азотфиксации». Такой взгляд ни на чем не основан, тем более что клубеньковые бактерии, внесенные в почву, способны довольно энергичйо размножаться в ризосфере, образуя эти аминокислоты и белки своего тела, построенные из них.

Таким образом, можно сделать вывод лишь о переходе части фиксированного азота в окружающую среду. Весьма вероятно, что это происходит в виде аммиака.

Виртанен и фон Гаузен, видимо, совершенно не знали о статье Виноградского 1933 г., так как они о ней не упоминают. В своем сообщении на конгрессе в Лондоне, который происходил в июле, Виртанен [20] не указывает также и на статью Виноградского 1936 г., появившуюся г, марте [19], и снова настаивает на том, «что выделяемые аминокислоты Должны рассматриваться как первичные продукты спмбпотическоп фиксации». Торнтон не преминул напомнить — как это уже было указано выше,— что присутствие аминокислот вполне может зависеть от деятельности клубеньковых бактерий, «развитие которых вне растения может быть значительным».

Как бы то пи было, но с того времени, как было установлено, что выделение аммиака происходит в течение всего периода вегетации, невозможно было с физиологической точки зрения приписать это выделение прямому дезаминированшо. В таком случае пришлось бы признать этот процесс нормальным и, более того, принять, что он происходит в условиях недостатка связанного азота в среде! Энзиматический синтез аммиака, как процесс не строго уравновешенный, не является тесно увязанным в смысле своей интенсивности с ростом и с потреблением аммиака — этого первого или главного устойчивого продукта фиксации азота. Поэтому нам кажется, что в случае симбиотической фиксации допущение возможности такого синтеза аммиака точно так же может служить наиболее вероятной гипотезой. Несомненно, что только количественные доказательства смогут сделать ее вполне достоверной, но надо думать, что, следуя по пути, намеченному ею, удастся лучше овладеть этой проблемой.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ