АЗОТОБАКТЕР

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

МЕСТНЫЙ ЗЕЛЕНЫЙ ШТАММ

Местный штамм азотобактера был выделен на пластинке кремнекислого геля, пропитанной этиловым спиртом; он никогда не пересевался на среды с сахаром.

Нормальное развитие. Возьмем серию из семи конических колб с 30 см3 питательной среды, приготовленной по вышеприведенным рецептам. Заразим каждую одной петлей микробной взвеси, взятой после взбалтывания, и поместим в термостат при температуре в 30°. Обозначим культуры по названию питательного вещества, которое они содержат.

Через 20 часов в колбах с этиловым спиртом и солями масляной и уксусной кислот уже замечается легкая опалесценция. Колбы с маннитом if глюкозой отстают на несколько часов, с нормальным бутиловым спир- ом — на 48 часов и с бензойнокислым кальцием — на 3—5 дней. Эта разница в быстроте, с которой начинается развитие, иными словами, разница и энергии размножения клеток, приблизительно постоянна и дает представление о той легкости, с которой ассимилируется то или иное внесенное питательное вещество.

Кроме того, совершенно очевидно, что если хотят обнаружить гомологичные стадии развития в серии заготовленных культур, то следует считать их возраст не с момента заражения, а с момента наступления размножения 13 культурах, что определяется по появлению опалесценции в жидкости.

Как только опалесценция замечена, надо сейчас же приступать к первым микроскопическим наблюдениям по способу, указанному ранее. Рост в это время еще слабый. Однако в висячей капле уже можно найти, особенно по ее окружности, некоторое количество спокойно и медленно движущихся палочек. Их в капле достаточно, для того чтобы убедиться, что культура состоит из крупных толстых палочек с закругленными концами, размером 2,0—2,5x1,2—1,5 [х.

На третий день жидкость в колбах сильно мутнеет. В висячей капле подвижность клеток сохраняется, но прежние формы в виде палочек уже больше не встречаются. Препараты состоят целиком из округлых и овальных клеток.

К этому времени (3-й или 4-й день) жидкость принимает серо-зеленый оатенок, который скоро превращается в зеленый, красивого флуоресцирующего тона.

Этот цвет легко воспроизвести при помощи раствора флуоресцеина, беря его около 8 мг на 4 л воды. Если налить 30 мл этого раствора в такую же колбу, как опытные, прибавить в нее столько же мела и дать ему осесть, то нельзя заметить никакой разницы между приготовленным подкрашенным раствором и культурой на этой стадии развития.

Окрашивание не является неизменным макроскопическим признаком, свойственным штамму. Оно появляется только в присутствии этил о- вого спирта, маннита и глюкозы; его нельзя увидать, несмотря на интенсивность размножения, при наличии в средах нормального бутилового спирта и мае л я но-, уксус- н о- и б е н з о й н о к и с л ы х солей. Иногда замечается некоторое окрашивание в присутствии масляно- и бензойнокислых солей, но оно скорее желто-бурого тона.

На 4—5-й. день рост сосредоточивается на поверхности жидкости в колбе, образуя хрупкую пленку, которая распадается на желтоватые хлопья при малейшем сотрясении. На этой стадии микроскопическая картина претерпевает новое изменение: клетки становятся все более и более кокковидньтми, уменьшаясь в размерах.

Таким образом, в течение развития нашего штамма наблюдается правильная смена форм: толстая и относительно крупная палочка приобретает через несколько последовательных этапов сначала овальную форму и, наконец, коккообразную, постепенно уменьшаясь в размерах.

В некоторых ненормальных случаях это уменьшение в величине приводит как мы увидим, к культурам, целиком состоящим из мельчайших кокко- образных форм, не превышающих 1 JJ. В диаметре. Здесь наблюдается явление, описанное у водорослей Schizophyceae; оно получило название нан- ноцитоза, т. е. образование карликовых клеток. Имеется полное основание применить этот термин и к нашим Schizomycetes, несмотря на некоторую разницу в той роли, какую это явление играет в этих двух случаях. Для водорослей оно считается определенно нормальным, в то время как у наших бактерий оно нормально лишь до известной степени, что мы постараемся сейчас уточнить.

можно отметить, что все превращения в культурах совершаются с замечательной одновременностью, что индивидуальные отклонения не нарушают однородности картины и что отклоняющиеся формы, в какой-то мере ые подчиняющиеся ходу развития, совершенно отсутствуют.

Но вот наступает стадия, наиболее знаменательная в цикле развития штамма: появляются покоящиеся формы, функционально соответствующие бациллярной споруляции,— наступает инцистирование. Фиг. 4 табл. XXX воспроизводит эту стадию еще в самом начале; цисты разбросаны между вегетативными коккообразными и овальными клетками, которые переходят в стадию покоя, одеваясь характерными капсулами.

Приведенная общая схема развития, не считая некоторых возможных отклонений, относится к культурам, выращенным на этиловом и нормальном бутиловом спиртах и на масляно-, уксусно- и бензойнокислых солях. Здесь во всех случаях встречаются одинаковые гомологичные стадии и в одинаковой последовательности.

Для того чтобы завершить наглядное подтверждение установленной нами схемы развития азотобактера, добавим к только что описанным изображениям культур микроба, выращенных на этиловом спирте, еше серию изображений цикла его развития на среде с уксуснокислой солыо в качестве питательного вещества

Что касается культур на глюкозе и мапните, которые не подходят к описанной схеме нормального развития, то мы ими займемся позднее, после того как опишем отклонения, свойственные нормальному развитию микроба. Эти отклонения касаются главным образом образования цист. Инцистирование в старых культурах нормально бывает полным, т. е. идет до исчезновения почти всех вегетативных форм; иногда же оно становится лишь частичным и, наконец, наблюдаются случаи, когда инцистирования' вовсе не происходит даже в течение очень долгого срока — шесть недель и более

Роль факторов, вызывающих эти отклонения, играют различные питательные органические вещества.

Так, при внесения нормального бутилового спирта инцистирование обычно бывает наиболее полным. Оно происходит через 5—6 дней.

При применении масляно-, уксусно- и бензойнокислых солей оно запаздывает и часто становится не таким полным, но подчинить это явление какой-либо определенной закономерности не удается; на этих средах процесс часто замедляется вдвое.

Удивительно, что инцистирование наименее правильно протекает в присутствии этилового спирта. Мы довольно часто наблюдали культуры, я которых количество цист было так незначительно, что они встречались на препаратах единично, и то после многих недель культивирования. ]-> этом случае уменьшение размеров клеток, которое нормально прекращается вследствие инцистирования, продолжается еще некоторое время, что ведет к образованию мельчайших коккообразных форм диаметром в 1 «л и меньше. Этот шп образования карликовых клеток мы считаем явлением ненормальным, так как он сопровождается их автолизом. После дегенерации такие культуры плохо восстанавливаются. Фиг. 12 табл. XXXII представляет культуру такого типа в стадии автолиза. Здесь легко найти много мельчайших клеток, превратившихся в «тени».

Это свойство этилового спирта в наименьшей степени способствовать инцистироианию клеток, но сравнению с остальными пятью выбранными нами для опытов питательными веществами, трудно объяснить, так как этот спирт часто казался нам излюбленным питательным веществом азотобактера.

Действительно, в только что описанных опытах с внесением этилового спирта опалесценция развивалась рано, рост в жидкости происходил быстро, а зеленое флуоресцирующее окрашивание появлялось постоянно и было особенно интенсивным.

Интересно, что этот «недостаток» может быть исправлен прибавлением к этиловому спирту небольшого количества нормального бутилового в 1 следующих соотношениях: на 0,15 мл этилового спирта берут 0,05 мл нормального бутилового. То же самое достигается прибавлением 0,05 г или немного больше маслянокислого кальция. Именно такая смесь кажется нам наиболее благоприятной для развития культуры.

Рост на глюкозе и маните

«Нормальное развитие» в этом случае нарушено с самого начала. При просмотре культур на тех же ранних стадиях развития, что и в других случаях, в них нельзя было обнаружить толстых палочек, встречавшихся в ранее описанных опытах (фиг. 1 табл. XXX и фиг. 5 табл. XXXI), или же их существование было столь кратковременно, что их не удавалось наблюдать. Первыми в культурах появлялись округлые и овальные подвижные клетки. На этой первоначальной стадии развития микроскопическая картина культуры отличалась относительной однородностью, которая быстро утрачивалась. Клетки, различные по форме тт величине, давали странно разнородную картину. Естественно возникал вопрос, чем это явление вызывается, имея в виду, что размножение делением приводит к формам, очень сходным между собой. Очень быстро можно было убедиться, что причина кроется в и о ч к о в а н и и к л о т о к, в форме размножения, необычной для бактерий. Несмотря на то, что подобное почкование происходило в очень умеренных размерах, так что лишь некоторые клетки образовывали почки, в то время как остальные делились нормально, все же этого было достаточно, чтобы нарушить однородность культуры. Почка сформировывалась, не достигая величины клетки; в некоторых случаях она, отрываясь напоминала по размерам маленький кокк.

Возможно, что именно эти-то оторвавшиеся почки и являются так называемыми «гонидиями» некоторых авторов; может быть, к ним же применялся и термин экзоспоры. С ботанической точки зрения такая терминология ведет к путанице, так как в нашем случае вопрос не может итти о специальных органах размножения, подобно тому как это бывает у грибов, даже если принять, что коккообразная почка способна развиваться в нормальную клетку.

Мы уже отмечали довольно ясное различие в поведении нашего штамма на средах с глюкозой и с маннитом. На глюкозе ненормальные отклонения всегда выражены резче, тогда как на манните картина более приближается к нормальной. Однако при слабой концентрации глюкозы в 0,3% азотобактер редко образует такие уродливые формы, какие так часто описывались.

Главное отклонение от нормального цикла развития касается образования цист. Последние всегда встречаются в культурах в известном количестве, которое, однако, ограничено и непостоянно. Этим объясняется, почему на них всегда смотрели, как на образования непостоянные и второстепенные. На глюкозе они редко появляются в большем числе, чем 1 на 100 вегетативных клеток. Но мало того: на питательной среде с глюкозой сформировавшиеся цисты часто оказываются неспособными исполнять функцию покоящихся форм, приписываемую им. Они не обладают внешностью нормальных цист, начиная с их величины, которая часто вдвое и втрое превосходит нормальную. При длительном пребывании в жидкой питательной среде их центральное тело, клетка, судя по преломлению и неспособности к окрашиванию, видимо, подвергается жировому перерождению.

Поучительно сравнить эту фотографию с фотографией фиг. 10 табл. XXXII, сделанной с нормально инцистировавшихся клеток, взятых из культуры, хранившейся на полке в лаборатории около двух лет. В этой культуре нормальные цисты не претерпели ни малейшего изменения.

Таким образом, описанные отклонения, как это видно, возникают немедленно в результате действия Сахаров в слабых концентрациях. Чтобы проследить за длительным влиянием тех же веществ в высоких концентрациях, принятых для наших обычных сред, мы наблюдали за двумя параллельными рядами культур на глюкозе и на манните, перевивая их каждый месяц и сохраняя остальные условия одинаковыми с условиями предыдущих культур. В поставленных опытах возобновление культур шло быстро, рост был обильный, пленка на поверхности жидкости получалась более толстая, чем в других случаях, зеленая флуоресцирующая окраска была ясно выражена.

Что же касается микроскопической картины, то она стала еще более разнородной вследствие более интенсивного почкования и все более й более ограниченного образования цист. В культуре второго пересева, доказанной на фиг. 16. табл. XXXIII, еще встречается несколько цист. До начиная с четвертого пересева, они совершенно исчезли и штамм полностью лишился цист.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ