Вся электронная библиотека      Поиск по сайту

 

Виноградский. МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ

АЗОТОБАКТЕР

 

С.Н. Виноградский

С.Н. Виноградский

 

Смотрите также:

 

Биография Виноградского

 

Микробиология

 

Почва и почвообразование

 

Почвоведение. Типы почв

 

растения

 

Геоботаника

 

 Биографии биологов, почвоведов

Биографии почвоведов

 

Эволюция

 

Биология

 

Эволюция биосферы

 

Геология

геология

Основы геологии

 

Геолог Ферсман

 

Геохимия - химия земли

 

Гидрогеохимия. Химия воды

 

Минералогия

минералы

 

Химия почвы

 

Круговорот атомов в природе

 

Книги Докучаева

докучаев

 

Происхождение жизни

 

Вернадский. Биосфера

биосфера

 

ЭНЗИМАТИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ АММИАКА В ПОЧВЕ И В ВОДЕ

 

В статье, представленной мною Академии Наук в 1930 г. [1], мною был установлен факт выделения аммиака культурами азотобактера на пластинках из кремнекислого геля, совершенно лишенных связанного азота.

 

В работе, появившейся в 1932 г. [2], были опубликованы следующие выводы:

1.         Рост азотобактера в указанных ниже условиях, за немногими исключениями, всегда сопровождается выделением свободного аммиака.

2.         Это выделение незначительно и запаздывает или его нет в присутствии «хороших питательных веществ», как-то: маннита, глюкозы и молочнокислого кальция.

3.         Более раннее и более обильное выделение аммиака наблюдается в условиях, в которых величина рН быстро поднимается, приближаясь к 9,0.

4.         Щелочные соли органических кислот — масляной, уксусной, молочной и бензойной — особенно благоприятствуют раннему выделению аммиака в результате повышения величины рН, что является немедленным следствием начавшегося размножения азотобактера. Кальциевые соли тех же кислот не вызывают такого эффекта, из чего можно заключить, что действие их зависит от катиона.

5.         Применение этилового спирта, широко распространенного в природе, особенно рекомендуется в качестве органического питательного вещества, если дело касается углубленного изучения явления в условиях до некоторой степени нормальных.

6.         Выделение аммиака, слабое в молодых культурах, увеличивается в стареющих, в которых уже начинает ощущаться недостаток питательных веществ. Максимум достигается во время автолиза и отмирания клеток.

7.         Вещество клеток, после того как последние отмерли, высохли и распались, продолжает выделять аммиак в течение нескольких месяцев. Загадка этой непрерывности остается неразрешенной.

8.         В результате указанных наблюдений была выдвинута гипотеза, что в случае выделения аммиака культурами азотобактера мы имеем дело не с процессом дезаминирования, но с явлением синтеза, осуществляемого каталитически при помощи специальной энзимной системы.

 

Наши выводы вызвали критику со стороны Бэрка и сотрудников [3]- Мы на нее уже отвечали [4], так что в настоящей статье мы вернемся к ней лишь в свете полученных нами новых результатов при описании наших опытов и при их окончательном обсуждении.

 

Длинная серия экспериментов, проведенных упомянутыми авторами,— большей частью при помощи микроманометрической методики,— должна была доказать, что выделение аммиака объясняется исключительно автолизом клеток, которые в результате истощения от недостатка питания претерпевают окислительное дезаминирование.

 

Мы постараемся в настоящей статье проверить такое заключение и выяснить, не служит ли источником выделяемого аммиака запас азота в клетках, фиксированный ими самими, что как раз могло быть в условиях, отмеченных американскими учеными, а именно: 1) когда клетки стары, 2) когда ощущается недостаток в питательных веществах.

 

Но если выделение аммиака бывает и вне таких условий, как на это, повидимому, указывают наши предварительные опыты, то вторично возникает вопрос, не происходит ли выделяемый аммиак, по крайней мере частично, из другого источника, которым является его синтез путем гидрогенизации молекулярного азота.

Ничто не противоречит допущению, что аммиачный азот, выделяемый культурами азотобактера, может быть двойного происхождения, но очень трудно определить, какая его часть принадлежит тому или другому источнику. Точно так же легко впасть в ошибку, направляя исследования исключительно в сторону одного из этих явлений, столь различных по своей природе.

Мы надеемся разъяснить этот вопрос, устанавливая баланс азота в культурах на кремнекислом геле, лишенном связанного азота, при помощи методики, описание которой следует ниже.

Наконец, надо вернуться к случаю с мертвыми клетками, чтобы постараться доказать количественными опытами, что аммиак, который они выделяют, может быть продуктом лишь энзимного синтеза.

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ МЕТОД

Постараемся кратко описать детали методики, чтобы при изложении наших опытов более к этому не возвращаться.

Мы пользовались исключительно пластинками из кремнекислого геля, способ приготовления которых неоднократно указывался в наших работах, так же как и рецепты растворов минеральных солей для их пропитывания. К последним прибавляют небольшие количества карбоната кальция или щелочного карбоната магния, достаточные для того, чтобы после высыхания минерального раствора поверхность пластинок покрывалась тонким слоем карбоната. Пластинки стерилизуют в автоклаве при 120°. Целость геля иногда, вследствие этого, несколько нарушается, но это не имеет значения, поскольку пластинки предназначаются не для морфологических исследований. Часто бывает достаточно простого промывания пластинок кипящей водой.

Мы пользовались для опытов чашками Петри, диаметром 10, 20 и 25 см, в зависимости от надобности.

Вместе с питательными минеральными солями пластинки получают порцию органического вещества, лучше всего абсолютного спирта или солей органических кислот — масляной или бензойной.

Что касается культур азотобактера, то мы пользовались штаммами, изолированными непосредственно из почвы и воды, избегая коллекционных штаммов, сохраняемых на стандартных средах с сахаром. Два вида азотобактера — Az. vinelandiin Az. agilis (Azomonas) были выбраны для опытов вместо группы chroococcum, которой мы пользовались в работе 1932 г.

Виды с зеленым пигментом, Az. vinelandii и Azomonas, предпочтительнее потому что первый на этиловом спирте образует лишь очень мало покоящихся форм — цист, второй же не дает их вовсе. Таким образом, в этом случае можно быть уверенным, что работа ведется с вегетативными клетками без примеси покоящихся форм, которые ведут себя иначе с точки зрения интересующего нас явления. Посев всегда производился по всей поверхности пластинки при помощи суспензии, относительно богатой клетками микроба.

Небесполезно сделать несколько замечаний относительно методов определения количеств фиксированного азота и азота, выделяемого пластинками, хотя этой методикой мы уже пользовались в наших предыдущих исследованиях.

Определения фиксированного азота производились после 6—10 дней инкубации при 35°, в зависимости от количества питательного вещества. В случае этилового спирта время его исчезновения легко узнается по запаху; после того как он совершенно исчезнет, чашку Петри мы держали в термостате еще 24 часа, для большей уверенности, что питательное вещество полностью использовано. После добавления к культурам разбавленной соляной кислоты открытые чашки Петри помещают на металлическую пластинку, подогреваемую до 50—55°, и культуры высушивают. Через 24 часа слой геля превращается в мелкий песок, который осторожно без потерь переносят в колбы Кьельдаля. Мы работали по возможности микрометодом Кьельдаля — колбочки в 50 см3, перегонный аппарат Вагнера с кварцевым холодильником. Если масса кварцевого песка была слишком объемиста для колбочки в 50 см3, то мы пользовались колбой в 100 см3; в этом случае остаток после сжигания в серной кислоте доводили до 100 см3, прибавляя в колбу дистиллированную воду, затем жидкость охлаждали и брали 10 или 20 мл для перегонки. Перегонку мы повторяли два или три раза, сколько это было необходимо, чтобы результаты точно совпадали.

Сжигание обычно идет быстро, перегонка берет не более трех минут после начала кипения. Перегнанный дистиллят исследуется с реактивом Несслера.

Что касается последней манипуляции, то следует проверять чувствительность применяемого реактива, который должен вызывать хорошо заметное окрашивание в пробирке Несслера с 50 мл дважды дистиллированной воды, содержащей 1 у аммиачного азота. Пользуясь для приготовления реактива рецептом, рекомендованным Тредвеллом, очень легко удовлетворить этому требованию (см. Lehrbuch Anal. Chemie, I, стр. 62).

Для того же, чтобы следить за выделением аммиака культурами азотобактера, мы придерживались методики, которая состоит в том, что при помощи реактива Несслера испытывают конденсационную воду, накапливающуюся на внутренней поверхности крышек чашек Петри с этими культурами. Только в данном случае мы постарались применить эту методику как количественную или скорее полуколичественную.

Пластинки из кремнекислого геля отдают много воды при температуре термостата. Это испарение может быть усилено и продолжено по желанию, если возмещать гелю потерянную им воду. Чтобы усилить испарение мы помещали чашку Петри на поверхность, подогреваемую в зависимости от надобности до 40—55°, и ставили на нее плоскодонную колбу, наполненную холодной водой, которая служит холодильником. При этих условиях уже через 20 минут крупные капли воды обильно конденсируются на крышке чашки Петри; мы их удаляли при помощи небольших количеств дважды дистиллированной воды и определяли в них аммиак реактивом Несслера. Очень быстро можно научиться манипулировать таким образом, что обильная роса не капает с крышки на пластинку и не стекает наружу. Главное, это пользоваться двумя крышками, сохраняя запасную для замены при температуре 60—65°. Действуя все время совершенно одинаково, в одних и тех же условиях получают достаточно сходные между собой цифры. Число таких возгонок, проводимых на одной и той же чашке при невысокой температуре, может быть неограниченно; объединяя цифры полученных определений, можно определить общую продукцию аммиака за известный период времени или же общее количество выделенного аммиака вплоть до окончательного прекращения его выделения.

Недостатки этого несколько примитивного метода очевидны. С одной стороны, он допускает потери аммиака, размер которых невозможно определить, с другой — он слишком зависит от трудолюбия наблюдателя, т. е. от числа и частоты проведенных им исследований конденсата. Тем не менее примененный так, как сказано в дальнейшем, этот метод позволяет следить непосредственно за выделением аммиака, давая представление об энергии процесса. Можно сократить число определений с помощью реактива Несслера, собирая вместе несколько конденсатов, доводя их до определенного объема и определяя в них общее количество аммиака, но все же необходимость повторять одну и ту же операцию в течение долгих месяцев делает эту работу утомительной. Конечно, мы пытались найти способ более «автоматический», а именно, мы пробовали выращивать культуры в колбе Ру, протягивая через нее при помощи насоса воздух, очищенный пропусканием через подкисленную воду. Но дистилляция аммиака происходила в этом случае лишь со скоростью 2—4 у азота в течение двух часов, а так как не могло быть и речи об ее ускорении посредством кипяче- шгя или разрежения, то волей-неволей приходилось придерживаться нашего «примитивного» метода. Для данного случая он оказался наилучшим не только вследствие быстрого и обильного испарения воды по отношению к ее общему объему, но особенно еще из-за необходимости проводить постоянный микроскопический контроль культур азотобактера.

Можно утверждать без риска ошибиться, что на среде, лишенной связанного азота, в присутствии таких малоценных питательных веществ, как этиловый и бутиловый спирты, соли масляной и бензойной кислот, лишь один азотобактер способен проявить такую энергию азотоусвоения, которая поддавалась бы измерению. Тем не менее тщательный контроль культур под микроскопом все же необходим даже и в том случае, если исследователь пользовался чистыми этикетированными штаммами, полученными из надежного источника. Мы уже обращали внимание на тот факт, что даже выделенные по всем правилам культуры азотобактера все же очень часто содержат посторонних зародышей в латентном состоянии [4, 7, 8], способных начать снова размножаться, когда среда обогатится азотом и продуктами автолиза. Угроза такого вторжения посторонних микроорганизмов значительно увеличивается, когда углеводным питанием является сахар, не говоря уже об азотном питании, которое ведет к подавлению развития азотобактера, часто вплоть до превращения его культур в своего рода пастбище для «микроба-вытеснителя». Незнание источника этих ошибок уже привело некоторых видных биохимиков к совершенно ошибочным заключениям (см. критический обзор, статья XV).

В нашем случае контроль должен продолжаться на протяжении всех опытов, во время которых возможность случайного загрязнения не исключена. Чтобы сделать этот контроль более эффективным, не увеличивая числа препаратов, мы наносили на поверхность пластинки, покрытой культурой азотобактера, небольшое количество стерильной воды, после чего покачивали чашку Петри, чтобы получить однородную суспензию. Препараты, приготовленные из такой суспензии, настолько одинаковы, что достаточно просмотреть два или три из них, чтобы составить себе точное представление о культурах, покрывающих пластинку. Большую каплю суспензии подсушивают, обрабатывают карболовым раствором виоламина, промывают и окрашивают водным, сильно разбавленным раствором генциана [7, стр. 359]. Наблюдатель, знакомый с морфологией азотобактера (необходимое услови е!), с первого взгляда узнает посторонние формы, если они встречаются в обильных и совершенно однородных культурах азотобактера. Особенно бросаются в глаза посторонние формы в виде палочек, даже если они встречаются в числе одной-двух в поле зрения. В таком случае культуры считаются «чистыми»; если же палочек, скажем, более нескольких десятков в поле зрения, то культуры считаются подозрительными. Однако последнее не препятствует продолжению наблюдений, так как смесь обильной культуры азотобактера со слабо развивающимся спутником характерна для специфической экологии этого азот- фиксатора.

 

ОПЫТЫ С КУЛЬТУРАМИ НА ПЛАСТИНКАХ

Для краткости мы будем задавать точные, вопросы и отвечать на них опытами, выбранными среди других как наиболее убедительные.

Все цифровые определения выражены в гаммах, за исключением тех случаев, когда они обозначены иначе.

Все пластинки засеяны видом азотобактера с зеленым пигментом, кроме тех случаев, где это оговорено.

Сокращения: П10, П20, П25 означает чашка Петри, диаметром 10 см, с 30 см3 геля, чашка Петри, диаметром 20 см, с 200 см3 геля и чашка Петри, диаметром 25 см, с 250 см3 геля, пропитанные соответствующим количеством минеральных солей: аз. ам.— аммиачный азот; амм. — аммиак; карб. Са — карбонат кальция; карб. Mg — щелочной карбонат магния.

I. Установлено ли, что выделение аммиака может начаться в молодой культуре, свободной от загрязнения? Все наши многолетние опыты сходятся в положительном ответе на этот вопрос. Те эксперименты, которые приводятся ниже, были специально поставлены, чтобы'основательно проверить это утверждение. Они сопровождались ежедневным микроскопическим контролем в течение первых десяти дней инкубации.

Опыт 1-й. № 1. П20. Питание: маслянокислый натрий в количестве 3 г. Карб. Са: 0,5 г.

№ 2. П20. Как № 1, но доза маслянокислого натрия 1,25 г. N° 3. Как № 1, но доза маслянокислого натрия 0,5 г. № 4. П20. Питание: абсолютный спирт 1 мл, карб. Mg 0,5 г. № 5. П20. Питание: бензойнокислый натрий 2,0 г, карб. Са 0,5 г. № 6. П20. Питание: абсолютный спирт 1 мл, карб. Mg 0,3 г. № 7. 5 П10. Питание: абсолютный спирт 0,2 мл, карб. Са 0,1 г.          одной

N° 8. 6 П10. Питание: маслянокислый натрий 0,1 г. Испытания проведены на од из шести опытных чашек.       одно-

Микроскопическая картина всюду обнаруживает процветающие, совеРше^первых родные и чистые культуры азотобактера. Никаких следов автолиза в течение р десяти дней не замечается.

 

В опыте № 3 (с 0,5 г маслянокислого натрия) и особенно в опыте № 4 (этиловый спирт и карб. Mg) число возгонок в течение одного и того же дня увеличено, но уменьшения продукции аммиака при этом не наблюдалось. Однако всегда применять такой способ было невозможно. Следовательно, большинство приводимых цифр лишь несовершенно отражает ход выделения аммиака.

 

Бэрк и сотрудники утверждали, что продукция аммиака в молодых активно растущих на пластинках культурах азотобактера объясняется неравномерным распределением питательного вещества в слое геля. Оно может быть местами полностью использовано и это может повести к местному истощению и автолизу клеток микроорганизма. Однако это мнение противоречит тому факту, что выделение аммиака происходит даже с самого н а.ч ала роста культур на пластинках в присутствии еще большого количества питательного вещества п за счет веществ, так же быстро диффундирующих в среду, как спирт. Таким образом, здесь не может быть вопроса даже о самом ограниченном, местном истощении пластинки питательным веществом.

В свете приведенных опытов способность молодых культур азотобактера выделять аммиак не оставляет никакого сомнения.

II. Значение качественного состава и количества углеродсодержащего питательного вещества. Как было указано, этиловый спирт является наиболее подходящим питательным веществом для изучения интересующего нас явления. В его присутствии развитие азотобактера совершается очень энергично, но без ненужного обилия; цикл развития проходит нормально, а величина рН относительно постоянна. Автолиз развивается в этом случае медленно* проходит всегда значительный промежуток времени между истощением» питательных веществ в среде и первыми симптомами автолиза. Это наблюдается при условии употребления карбоната кальция, но не магния.

Для опровержения мнения, объясняющего выделение аммиака исключительно дезаминированием автолитического происхождения, понятна важность установления факта автолиза на поздних стадиях развития. Кроме того, никаких следов автолиза, так легко обнаруживаемого под. микроскопом, не наблюдается в культурах с этиловым спиртом и СаС03 в. качестве основания, хотя выделение аммиака в них уже явно происходит.

В присутствии карбоната магния автолиз начинается раньше. Это еща резче выражено в опытах с масляно- и бензойнокислым натрием, откуда можно заключить, что щелочность среды благоприятствует этому явлению. Но это не мешает процветанию культур в течение логарифмического периода их размножения.

Нижеописанный опыт служит для сравнения действия маннита и глюкозы с этиловым спиртом,-который представляет собой своего рода эталон-

Опыт 2-й. Три П20. № 1 получает 1 мл этилового спирта, № 2—4 г глюкозы,. № 3—2 г маннита. На чашках № 2 и 3 через 48 часов развиваются культуры в виде густого слизистого налета. В чашке № 1 зеленое окрашивание появляется через 48 часов, сопровождаемое образованием пленки, покрывающей всю поверхность пластинки. Цифры таблицы относятся к одному конденсату.

 

Опыт подтверждает заключение, уже ранее высказанное нами в статье 1932 г., а именно, что в присутствии глюкозы и маннита с СаС03 в качестве основания выделение аммиака незначительно, оно запаздывает или отсутствует, особенно при применении маннита.

Результат этого опыта несовместим с мнением, которое приписывает клеткам азотобактера специальную способность к раннему дезаминиро- ванию. В опытах наблюдалась преднамеренно вызываемая различная энергия роста культур. Можно было бы ожидать гораздо более сильного выделения аммиака в обильных культурах азотобактера, развивающихся на глюкозе, в которых клеточная масса была несравненно объемистееТ чем в случае этилового спирта. Но наблюдалось как раз обратное.

Только один опыт был поставлен с нормальным бутиловым спиртом в качестве единственного питательного вещества. Но его все же следует отметить из-за дано отрицательного результата, который он дал.

Опыт 3-й. П20— с 2 мл бутилового спирта, 0,2 г карб. Са. В течение^несколь- ких дней никакого роста. Лишь через две недели гель приобретает зеленый отт и покрывается тонкой пленкой.        пист

Микроскопирование показывает, что культуры состоят исключительно из ц картина, воспроизведенная на фиг. 7 и 8 табл. XXXI в статье XVI, которая каъа^^ морфологии азотобактера и в которой уже было отмечено стид1УлиРУющ^ОПОЛ7кали бутилового спирта на образование цист ("7]. Мы возобновили возгонки и пр д их в течение 20 дней, но никаких следов аммиака ис обнаружилось.

Таким образом, клетки в состоянии покоя не выделяют ни малейших следов аммиака. Интересный результат, которого, впрочем, можно было ожидать. Но не всегда его легко получить столь отчетливо, так как для этого инцистирование должно быть полным, а не частичным, как это нередко бывает.

Что касается дозировки питательного вещества, то, конечно, должно существовать количественное соотношение между нею и общей продукцией аммиака. Однако это трудно установить вследствие продолжительности выделения аммиака, так как количество его в каждый данный момент зависит от нескольких различных факторов, не связанных с количеством внесенного питательного вещества.

Совершенно достоверно, что выделение аммиака не вызывается непосредственно недостатком питательного вещества, как это утверждают Бэрк и Хорнер. В совместной работе 1935 г. [3] они приходят к выводу, что продукция аммиака становится ощутимой, когда процентное содержание глюкозы снижается до 0,01—0,03%. В настоящее время эти авторы настаивают, что отсутствие соединений, могущих окисляться, отсутствие питательного вещества является главным фактором, который способствует автолизу клеток и их дезаминированию. Совершенно верно, что в культурах с глюкозой выделение аммиака начинается иногда поздно, когда питательное вещество полностью или почти полностью истощено. Но обобщение этого факта является ошибкой, так как легко доказать, что, впрочем, уже и сделано, что выделение аммиака может начаться в культурах, в которых концентрация питательных веществ — таких, как этиловый спирт, «соли масляной и бензойной кислот — лишь едва изменена под влиянием роста азотобактера. Кроме того, с той же глюкозой выделение аммиака может наблюдаться и при концентрации, значительно превосходящей указанные выше проценты.

III. Действие повторных внесений питательных веществ в течение культивирования. Это влияние явно отрицательно, что уже было нами отмечено в нашей работе 1932 г. При условии истощения питательного вещества можно наблюдать, прибавляя новые, даже очень слабые дозы его, быстрое снижение выделения аммиака, сопровождаемое новым повышением последнего, по мере того как недавно прибавленное питательное вещество в свою очередь исчезает. Это явление очень характерно и его легко воспроизвести во всех старых культурах, но, само собою разумеется, при условии, что их клетки еще не утратили способности реагировать возобновлением роста на внесение свежего питательного вещества.

 

Опыт 5-й. Две П20. № 1— с 0,2 мл этилового спирта, № 2— без добавления. Каждая получает полностью 10-дневную культуру азотобактера в колбе Эрленмейера, потребившую 0,2 мл этилового спирта + 0,1 мл бутилового. Определения параллельные и произведенные немедленно: N° 1 дает 4, N° 2 дает 12. Через 24 часа: № 1 дает 10, N° 2 дает 40. Еще через день разница сглаживается.

IV. Влияние оснований или рН среды. Это влияние уже было обнаружено в сравнительных опытах с карб. Са, с одной стороны, и с карб. Mg, с другой. Еще более ясно выраженный эффект получается при сравнении действия маслянокислого натрия с маслянокислым кальцием при условии выравненного количества кислотных ионов.

Опыт 6-й. Две П20. № 1— с маслянокислым натрием, № 2— с маслянокислым кальцием. Оба опыта выдерживались при комнатной температуре.

С самого начала этих опытов было отмечено, что при более высоком рН, увеличивается выделение аммиака. Но в этом случае привлекало внимание то? что это выделение производилось молодыми клетками в состоянии наиболее активного развития. Возможно ли с физиологической точки зрения допустить существование значительного и регулярного распада и дезаминирования в клетках в период логарифмической фазы роста в среде, лишенной усвояемого азота?

V. Можно ли освободить пластинки от свободного аммиака при помощи многократных возгонок или прекратить его выделение, высушивая пластинки при невысокой температуре?

Опыт 8-й. П20 с этиловым спиртом и СаС03. В течение 10 дней ежедневно собиралось по 8 конденсатов. Определения, сделанные в 8 конденсатах и приведенные ниже, получены в течение двух дней, непосредственно следовавших за периодом такого усиленного собирания конденсатов.

Таким образом, иногда ощущается легкое уменьшение продукции аммиака в конце ряда произведенных возгонок, но как только пластинки оставляют «в покое», выделение аммиака возвращается к прежнему уровню по крайней мере в том случае, если оно еще не дошло до полного истощения.

Опыт 9-й. П20 с этиловым спиртом и СаС03 , засеянная Az. agilis, после выделения 5,544 у аз- амм- оставляется в течение 25 часов на пластинке, подогреваемой до 45°. При такой температуре гель растрескивается и не выделяет больше воды. Его увлажняют, подвергают возгонке и получают только 3 у. Через 24 часа пребывания в термостате в течение последующих дней мы снова начали усиленные возгонки и констатировали, что пластинка возвратилась к такой же продукции аммиака, как до высушивания. Приводим цифры в порядке их получения: 105; 110; 105; 62,5; 50; 75; 75 и т. д.

Не указывает ли столь долго не исчерпывающий себя процесс на явление, несовместимое с процессом разложения, который обычно протекает довольно быстро?

Эта особенность найдет себе более полное объяснение в следующем параграфе.

 

Продолжительность выделения аммиака. Баланс азота в пластинках

 

Несколько пластинок было подвергнуто возможно более длительному наблюдению с целью определить общую продукцию аммиака. Производился тщательный учет количеств аммиака, определяемых при помощи реактива Несслера, после чего оставалось лишь подытожить получаемые изо дня в день цифры, для того чтобы получить общее количество выделяемого аммиака.

Важность подведения такого итога, являющегося результатом многих сотен возгонок, совершенно очевидна, когда требуется установить происхождение аммиачного азота, этого главного предмета всех споров.

Предоставим культуре фиксировать атмосферный азот в тех пределах как это ей позволяет количество внесенного энергетического вещества. Определим азот на одной или нескольких пластинках, чтобы узнать его среднее содержание, и извлечем из остальных пластинок поставленной серии опытов — в точности одинаковых и содержащихся в тех же условиях — вместе с испаряющейся из них водой полностью весь аммиачный азот вплоть до момента прекращения этого выделения. Определим, наконец, азот, оставшийся в пластинках с закончившимся выделением аммиака. Мы будем располагать тогда тремя цифрами, которые необходимы для установления азотного баланса.

Если выделяемый аммиачный азот не превысит разницы между начальным и конечным количеством фиксированного азота в пластинках, то совершенно очевидно, что мы имеем здесь дело с процессом простого дезаминирования.

Если же, наоборот, выделяемый аммиачный азот будет постоянно и значительно превосходить эту разницу, в количествах, лежащих за пределами ошибки, то придется искать его источник в запасах атмосферы. Следы аммиака и нитратов, которые пластинки могли бы адсорбировать из окружающего воздуха, слишком не соответствуют количествам выделяемого аммиака, для того чтобы их можно было счесть за источник азота.

Обсуждая баланс азота, не надо забывать, что цифры начального и конечного азота устанавливаются микрометодом Кьельдаля со всей желательной точностью, тогда как определения при помощи реактива Несслера лишь приблизительны и, совершенно очевидно, ниже действительных, что может только увеличить их убедительность.

К сожалению, необходимость проделывать сотни возгонок и определений с реактивом Несслера, чтобы дойти до момента прекращения выделения аммиака, заставила установить полный баланс азота в пластинках по ограниченному числу опытов.

Часть опытов осталась незаконченной в том смысле, что ко времени второго определения азота по Кьельдалю выделение аммиака еще продолжалось, иногда даже еще и не приближаясь к прекращению.

Наконец, некоторые опыты будут приведены просто в качестве примера «большой продукции», при которой превышаются те несколько миллиграммов аммиачного азота, которые можно получить в этих условиях.

Опыт 10-й. П20 с 1,25 г маслянокислого Са. Ежедневные возгонки с 15 апреля до 10 августа.

Общая продукция приблизительно 200 возгонок: 5420 аз. ам.

Продукция последних четырех возгонок: 10, 10, 14, 10.

Выделение не прекратилось.

Опыт 11-й. П20 с 1,0 мл этилового спирта. Карб. Mg.

Приблизительно столько же возгонок с 20 мая по 10 августа.

Продукция последних четырех возгонок: 10, 6, 20, 10.

Выделение не прекратилось.

Опыт 12-й. Три П20 с 1 мл этилового спирта и карб. Mg. В двух П определяете» количество начального фиксированного азота. Получились две очень близкие цифры, среднее которых равно 9100. Третья П служит для определения выделяемого аммиака, с 7 февраля по 12 июля, т. е. в течение 155 дней.

Продукция шести последних^возгонок, собранных в одну и ту же пробирку, дает 75 аз. ам.

Выделение еще не прекратилось. Тем не менее определяем остаточный азот, чтобьв установить баланс на данный момент:

Азот фиксированный начальный              9100

Азот фиксированный конечный                5100

Разница                     3990

Азот аммиачный выделенный                   ....            5771

Излишек азота                      1781

Опыт 13-й. Серия из 6 П10 со 100 мг маслянокислого натрия. Карб. Са. В пластинках № 1, 2, 3 определяется азот по Кьельдалю. Результаты точно совпадают.

№ 4, 5, 6 подвергаются возгонкам с 27 апреля по 14 июня. Выделение не прекратилось.

Опыт 15-й. Серия из двух П20 с 0,1 мл этилового спирта. Карб. Са. Следует отметить небольшую дозу этилового спирта, отмеренную точной пипеткой. Таким образом, концентрация питательного вещества составляет лишь 0,05% на объем геля в 200 см3.

Заражение чистой культурой Az. agilis (Azomonas).

Несмотря на такую слабую дозировку, через 48 часов наблюдается прекрасн е' развитие интенсивно подвижного микроба.

Первые возгонки в это время дают 16,6 и 18. В № 1 определяется азот по Кьельдалю через 8 дней, в то время как № 2 подвергается возгонкам, которые тянутся с 5 Mart по 3 октября, т. е. около 150 дней, в течение которых проводят около 800 возгонок1. Большей частью мы проводили по 10 возгонок в день, собирая конденсаты в пять, пробирок. Таким путем мы старались составить приблизительное представление об- образовании аммиака и о кривой его выделения как функции времени.

Достаточно сравнить между собой цифры, соответствующие итогам ежедневных определений аммиака при помощи реактива Несслера, чтобы заметить, что они держатся на известном уровне в соответствии с возрастом культуры.

Аммиак начинает выделяться через 24 часа в виде следов. В течение пяти дней следующих за первыми 48 часами инкубации, мы получили последовательно ряд цифр[ которые приводятся ниже. Последняя цифра служит уже переходом к периоду максимального выделения аммиака: 18; 18; 10; 14,3; 60.

Максимум продолжается с 12 по 18 мая: 120; 137; 160; 143; 135; 113; 105.

С 23 по 29 мая первое снижение: 95; 94,7; 97,7; 96,7; 93,7.

Общее количество за день держится на этом уровне, за исключением некоторых отклонений, до июля. Затем мы получили цифры: 65; 55,5; 64,5; 54; 68.

С этого времени до половины сентября никаких признаков снижения: последнее определение с реактивом Несслера дает цифру немногим ниже цифры первого определения. Признаки снижения появляются лишь после отмеченной даты. Тогда получают: 15; 8; 5; 4; 4.

Наконец, 1 октября: 8; 3; 0,5; 0,6; 0.

:3 октября: 1; 0; 0; 0.

{Выделение прекратилось.

На графике 79 ось абсцисс разделена на отрезки, соответствующие числу дней; ординаты представляют ежедневную среднюю продукцию аьмиака в гаммах, определенную в течение различных промежутков времени.

 

Кривая с первого взгляда дает довольно полное представление о ходе явления. Из нее. явствует, что выделение аммиака, начинаясь с первых стадий развития культуры, через несколько дней достигает максимума, чтобы затем чрезвычайно медленна оадать до полного прекращения.

Для установления баланса имеются, к сожалению, лишь две цифры:

Азот фиксированный начальный   1141

Азот фиксированный конечный    Не определялся

Азот аммиачный выделенный        • . 6459

Таким образом, количество выделенного аммиачного азота в шесть раз больше фиксированного начального. Но разница между количествами азота начального и азота конечного, которая является основой для наших расчетов, у нас отсутствует. Предполагая, что количество конечного азота не превосходит 50% начального, можно условно принять эту разницу за 550, т. е. в двенадцать раз ниже количества действительно выделенного аммиачного азота.

Опыт 16-й. П20 — с кремнекислым гелем, ничем не пропитанным. На него наг ливают 25 мл чистой 10-дневной культуры азотобактера в минеральном растворе с 0,1 мл этилового спирта и карб. Са.

Прибавляют 1 мл абсолютного спирта.    ^ „ части

Пластинку подвергают ежедневным усиленным возгонкам в течение оольшеи ч<* ^ того времени, которое в общей сложности длится со 2 декабря 1939 г. до полов октября 1940 г.

В течение этого времени было проведено около 900 возгонок.

Через 48 часов хорошее развитие пленки.

В это время первая возгонка уже дает 43.

На следующий день 90.

 

ВЫДЕЛЕНИЕ АММИАКА МЕРТВЫМИ КЛЕТКАМИ

 

Только что описанные опыты с полной очевидностью доказывают, что выделение аммиака, постепенно снижаясь, продолжается в течение очень долгого времени, когда жизненные отправления клеток уже прекратились и сами клетки совершенно разрушились.

Отсюда следует, что можно было бы пользоваться для опытов мертвыми клетками вместо культур, проходящих через обычные фазы развития. Такой способ исследования представлял бы даже известные преимущества так как этим путем исключались бы все неопределенности, связанные с жизнью клеток.

Работая с безжизненными, высушенными клетками, исследователь имел бы дело со стойким веществом, накопившимся в силикатной среде и содержащим те из своих энзимов, если таковые имеются, которые не поддаются разрушению.

Опишем метод, каким мы пользовались, чтобы приготовить такие высушенные клетки в достаточном количестве 250 см3 геля пропитывают 10 мл солевого раствора, в который прибавлено 0,5 г карб. Са. Стерилизация в автоклаве. 5,0 мл абсолютного спирта наносят по каплям на поверхность пластинки и дают ему впитаться. Лучше вносить спирт по частям по 1—2 мл через каждые два дня. В этом случае культура развивается быстрее.

Если пластинку заражать, покрывая суспензией азотобактера всю ее поверхность, то приблизительно через три дня образуется густая, окрашенная, точно прилипшая к гелю пленка.

Дней через двенадцать, когда пластинка перестает издавать запах спирта, надо оставить ее открытой в течение 24 часов, подогревая снизу до 50— 55°. Тогда слой геля, высыхая, превращается в мелкий «песок», покрытый совершенно высохшей культурой. Растирая в ступке тяжелым пестиком, превращают этот «песок» в мелкий тонкий желтоватый порошок, достаточно богатый клетками азотобактера. В последнем можно убедиться, микроскопируя и определяя общий азот, количество которого обычно приближается к 1 %, тогда как общий азот центрифугированных и высушенных клеток, по Омелянскому и Зиберу, достигает 2,2.

С каждой большой пластинки можно получить от 6 до 7 г тонкого мелкого порошка, который, хорошо высушив, можно сохранять для опытов в термостате неопределенно долгое время.

Как показывает микроскопический анализ, не все клетки полностью разрушаются даже после длительного растирания в ступке. То тут, то там встречаются группы клеток почти нормального вида. Но сохранившиеся вегетативные клетки азотобактера не переносят высушивания и вскоре совершенно разрушаются. Остаются одни цисты, но они так редки в этих условиях, что их трудно обнаружить под микроскопом. Однако одна или две сотых грамма порошка, внесенного в питательную среду, довольно регулярно вызывают развитие азотобактера.

Понятно, что этот порошок гораздо более подходит для изучения азотного баланса, чем живые клетки. Его общий азот определяется со всей возможной точностью, и эти определения не нуждаются в возобновлении в случае новой серии пластинок. Точность анализов позволяет пользоваться минимальными количествами исследуемого вещества, а это в свою очередь ведет к сокращению продолжительности опытов.

Ввиду того что трудно осуществить асептическое приготовленпе порошка, мы старались, работая с ним, предотвратить всегда возможное загрязнение. С этой целью мы стерилизовали при 120° отдельно порошок или всю пластинку, засеянную порошком. Если мы хотели избежать стерилизации жаром, то обрабатывали засеянную пластинку толуолом, распределяя несколько капель последнего по ее поверхности и возобнов ляя эту дозу через каждые 24 часа.

 

Опыт 17-й. Шесть П10 стерилизуют без пропитывания. Поверхность пластинок покрыта тонким слоем карб. Са. Распыляют порошок в количествах, указанных в нижеприводимой таблице. Пластинки помещают до начала возгонок на несколько часов в термостат, затем в течение 15—20 дней их подвергают тому же режиму возгонок с применением реактива Несслера, который был использован по отношению к культурам. К концу этого времени выделение аммиака еще не прекращается.

Несмотря на слабую продукцию аммиачного азота, баланс на данный момент этих шести порций порошка характеризуется одной общей замечательной особенностью, а именно:

Номера порций         Порошок образец А, г            Азот начальный в порошке (0,913%), у            Азот конечный, Y    Разница + или —, у            Азот аммиачный выделенный, у

1          0,074   676      697      +21      244

2          0,049   447      468      +21      147

3          0,204   1862    1875    +13      470

4          0/0515 470      500      +30      86

5          0,058   529,5   545      +15,5   159

6          0,034   310      353      +43      96,5

 

количество конечного азота остается равным начальному, который, таким образом, не испытывает никакой потери вследствие выделения аммиака. При внесении в полученные цифры поправки на примененные реактивы, которая достигает 30 у, разница в сторону увеличения заменяется незначительной потерей, что не может изменить значение общего результата.

В свете этого важного наблюдения, с несомненностью доказывающего, что в данном случае не происходит дезаминирования, было интересно, для проверки методики, провести опыт с организмом, безусловно неспособным к фиксации свободного азота. Для этих целей были выбраны хлебопекарные дрожжи.

Опыт 18-й. От 1 до 2 г дрожжей размешивают в 1 л воды; дают им осесть, сливают воду и снова повторяют это обильное промывание. После окончательной декантации распределяют довольно густую суспензию по пластинке кремнекислого геля.

Высушивают при 50°, превращают гель в мельчайший порошок. Определяют общий азот.

В результате шести сходных между собой определений по Кьельдалю количество общего азота выражается цифрой 1.26%.

Наносят полученный порошок на 3 П10 в дозах, отмеченных в нижеприводимой таблице.

Номера           Порошок из дрожжей, г      Азот начальный (1,26%), у          Азот конечный, Y            Азот аммиачный выделенный, у    Азот конечный азот аммиачный,

Y

1          0,0676 882      714      182,5   896,5

2          0,1060 1323    860      225      1085

3          0,1134 1463    1200    274      1474

 

Чтобы вызвать аммонификацию, мы произвели заражение микробом, выделенным из почвы.

Производили возгонку аммиака в течение промежутка времени от двух до трех недель, завершая опыт конечным определением по Кьельдалю.

В этом случае сумма выделенного аммиачного азота и азота остающегося в общем равна количеству начального азота, во всяком случае незначительно ниже его, так как дезаминирование еще не полное.

Количество аммиачного азота колеблется в пределах разницы между количествами начального и конечного азота. Таким образом, он является продуктом дезаминирования. Разница по сравнению с поведением азотобактера резко выражена.

Чтобы получить более энергичную продукцию аммиака, чем на П10, засеянных слабыми дозами, мы пользовались П20 и П25, на которых распыляли дозы порошка порядка 1—2 г.

Опыт 19-й. Две П20 промытые кицятком. Чистый гель без пропитывания. Распыляем по поверхности каждой пластинки 2 г одного и того же образца порошка с азотобактером. К одной из пластинок не прибавляем ничего, к другой прибавляем 10%-ный раствор бензойнокислого натрия. Через несколько часов пребывания в термостате извлекаем из одного порошка 40 аз. ам. Продолжаем возгонки аммиака в течение 8 дней, параллельно из обеих пластинок.

4 Получаем:

Порошок без Порошок +

добавления    бензойнокислы» натрий

2-        й          день     . 300   143

3-        й          »                       430     430

4-        й          »           430     430

5-        й          »           400     330

6-        й          »           303     225

Порошок без добавления остается'до конца совершенно чистым; порошок с но-кислым натрием обнаруживает легкое загрязнение небольшим числом бациллярны форм. Ясно, что эта инфекция скорее уменьшила, чем увеличила продукцию аммиак -

 

ОБСУЖДЕНИЕ

 

Соединим в одной таблице цифры определений азота двух серии опытов: серии, проведенной с культурами, и другой — с порошком.

Разберемся подробно в этих цифрах, чтобы найти в них ответ на в°провЫ1 которые мы поставили в начале нашей статьи. Напомним, что все цифры ражены в гаммах.

Серия с культурами

Номера опытов         12        15        16        13а            136      14

Азот фиксированный на     9100    1141    14 210                        

чальный ........                                               1113            2100    2100

Азот фиксированный ко     5110    570*                630                 

нечный                                              5 415               980      980

Потеря . . . . :             3990    570      8 795   483            1120    1120

Азот аммиачный выделен                                                             

ный                 5771    6459    17 855 980      1479            1514

Излишек                    1781    5889    9 060   497            359      394

Процент                     31        91        52        50            24        26

 

 В этом опыте недостает цифры количества конечного азота, но мы будем не далеки от действительности, если примем, что оно достигает 50% начального.

Серия с порошком

Номера опытов         1          2          3          4            5          6

Азот фиксированный на                                                                

чальный                     676      447      1862    470            529      310

Азот фиксированный ко                                                                

нечный                      667      438      1845    470            515      323

Потеря                       9          9          17        0            14        13

Азот аммиачный выделен                                                             

ный                 224      147      470      86        159            96

Излишек                    •235    138      453      86            145      109

 

Все опыты первой серии с культурами отличаются прежде всего большой потерей, которую испытывает фиксированный начальный азот. Эта потеря составляет от 30 до 50 % всего запаса фиксированного в культуре азота. Если принять, что потеря азота происходит только в виде аммиака, то надо сделать вывод, что весь выделяемый азот должен представлять целиком продукцию авто- литического дезаминирования.

Если обратиться теперь к данным серии «с порошком», то в этом случае, наоборот, можно констатировать, что количество начального азота ни в малейшей степени не изменялось в результате возгонок аммиака, так как потери не превышали ошибок определения. Понятно, что иначе не могло и быть, так как автолитическое дезаминирование является жизненным актом. Все же пластинки с мертвыми клетками выделяли определяемые количества аммиака в течение опытов, продолжавшихся только 20 дней. Весь этот азот может являться лишь продуктом синтеза за счет молекулярного азота без примеси продуктов автолиза.

Но, возвращаясь к серии с культурами, мы можем убедиться, что в этом случае весь выделяемый аммиачный азот не состоит исключительно из азота, образующегося вследствие автолиза, так как все культуры выделяли избыток его, значительно превосходящий потерю в фиксированном азоте от начального его запаса в культуре. Этот избыток аммиачного.

азота меняется, чо он всегда значителен. Он достигает последовательно 31, 91, 52, 50, 24, 26% общего количества аммиачного азота, выделяемого шестью культурами. В согласии с тем, что только что было нами принято этот излишек не может рассматриваться как продукт автолиза. Таким образом, мы принуждены признать, что аммиак, выделяемый нашими культурами, двойного происхождения: то автолитический аммиак, который преобладает, то синтетический.

Обращает на себя внимание, что продукция аммиака в результате дез- аминирования в значительной степени пропорциональна в большинстве случаев начальному запасу азота, т. е., иными словами, количеству внесенного питательного вещества, составляя около 50% этого запаса. Синтетическая же продукция аммиака не обнаруживает пропорциональности такого рода.

Что касается механизма синтеза, то возможность происхождения его за счет мертвых клеток указывает, что дело касается здесь каталитического действия, отделимого от жизненного процесса. Совершенно очевидно, что катализ может происходить лишь за счет веществ, способных к дегидрированию.

В настоящее время мы не имеем никакого представления о природе этой каталитической системы, которая термоустойчива до такой степени, что переносит нагревание в автоклаве до 120° в течение получаса.

Ранее уже отмечалась продолжительность опытов, которые тянутся целые месяцы до того времени, пока не наступит окончательное истощение в аммиачном азоте при условии внесения лишь очень небольших количеств питательных веществ, известных как малоценные. Их оказывается достаточно для такой продолжительной продукции аммиака.

Так, в опыте № 15 было внесено лишь 0,1 мл этилового спирта и за счет этой минимальной дозы выделение аммиака продолжалось 150 дней при продукции около 6000 у аммиачного азота, что в шесть раз превосходит начальное количество фиксированного азота. В опыте № 16 с 1 мл этилового спирта процесс поддерживался в течение 11 месяцев с выделением около 18 000 у аммиачного азота.

Что касается происхождения выделяемого азота, то вероятно, что аммиак, образующийся в молодых культурах, представляет собой продукт сицтеза и что выделение его в результате автолиза начинается лишь позднее в истощенных и стареющих культурах. В это время кривая общего количества выделяемого азота обычно достигает самого высокого уровня. Это будет период максимального выделения, который длится лишь несколько дней, после чего наступает настолько резко выраженное снижение, что можно было бы ожидать близкого прекращения выделения аммиака. Однако этого не происходит и выделение продолжается еще в течение долгого времени. Представляется вероятным, что короткий период усиленного выделения аммиака связан с началом развития автолитического дезамини- рования, продукция которого присоединяется к продукции синтеза, про исходящего все время, от самого начала развития культур и до полног истощения запаса водорода.

 

Конечно, все приведенные наблюдения и соображения претендуют л на то, чтобы правильно поставить вопрос относительно этой трудной ^р^ блемы, имея в виду дальнейшее ее изучение при помощи более точНО дова. периментальной методики. Но какова бы ни была судьба этИХбИСз^Ваяия ний в будущем, уже один факт постоянного и избыточного 0 Р*ъясняет аммиака, который может являться лишь продуктом синтеза, Р химическую природу процесса фиксации азота, так долго остававшуюся неясной. И это заставляет определить азотофиксацию как явление восстановления молекулярного азота с образованием аммиака в качестве первого устойчивого продукта.

Вопрос, предшествует ли синтезу аммиака образование менее гидро- генизированных соединений, как гидразин, остается, разумеется, открытым.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

Теория, которая считает синтез аммиака существенным этапом в круговороте азота, имеет вековую давность, так как она была выдвинута еще Соссюром [12]. Правдоподобие этой теории с химической и энергетической точек зрения признается всеми. Вместе с тем, образование аммиака, так легко обнаруживаемого при помощи чрезвычайно чувствительных реакций, а также и по запаху, должно было привлечь к себе внимание в такой мере, чтобы вызвать опыты, направленные специально на разрешение этой проблемы.

Поэтому удивительно, что она оставалась неразрешенной в течение нескольких десятилетий, со времени открытия азотобактера и до 1930 г., несмотря на упорные исследования в этой области микробиологов, агрохимиков и биохимиков.

Один только фитофизиолог Костычев (1926), исходя из аналогии, внушенной ему промышленным синтезом азота (способ Габера), попытался ранее указанной даты воскресить старую теорию. Однако это было сделано им с неподходящими средствами, так как более чем очевидно, что одно присутствие аммиака в культурах азотобактера еще ничего не говорило нам об его происхождении. Влияние таких факторов, как биологический распад или явления автолиза, не было полностью исключено в его опытах

В общем надо признать, что микробиология и биохимия еще не располагали в то время средствами, чтобы разрешить основную проблему процесса азотфиксации и выявить условия, необходимые для деятельности микро- бов-азотфиксаторов вне лаборатории, в природе.

Причину этого надо искать в методике, которой пользовались. Этой методике недоставало экологического подхода, самое широкое применение которого совершенно обязательно, когда надо выявить деятельность групп любых микроорганизмов в их природном окружении.

Исследования, внушенные этим принципом [1, 2, 7, 8, 10], устранили затруднения на этом пути, и тогда основная проблема относительно химической природы процесса фиксации азота была поставлена более четко. Этому способствовали наблюдения над той регулярностью, с какой происходило выделение аммиака. Начиная с 1930 г., синтез аммиака стал казаться более чем вероятным, несмотря на недостаток количественных данных для подтверждения этого предположения. Надо думать, что в этом случае количественные доказательства были бы более убедительными.

Предвидение этого конечного вывода привело к более определенному взгляду на важность роли азотобактера в природе, роли, о которой можно было лишь догадываться на основании исследований 1930 г.

В общем господствовало представление, что роль азотобактера узко ограничивается фиксацией азота, необходимого для процессов усвоения в клетках микроорганизма. Лишь после смерти последних связанный пми азот мог вступить в круговорот веществ. Автор настоящих строк сам разделял эти повсеместно принятые взгляды в его первых исследованиях по аэробным азотфиксаторам [5].

Другое понимание возникает в свете результатов, полученных в настоящей работе. Эти заключения можно резюмировать следующим образом*

1.         Азотобактер в первую очередь образует энзиматическую систему -I азогидразу, которая служит катализатором при синтезе аммиака. Часть образуемого аммиака, в соответствии с количеством получаемого углеродного питания, связывается клетками, остальное выделяете» наружу.

2.         Считая систему азогидразы катализатором при синтезе аммиака, логично будет признать, что дегидрирующее действие этого катализатора распространяется на питательные вещества при их использовании и затем даже на вещество самих клеток. Таким образом, молекулярный азот действует как акцептор активного водорода.

3.         Действие азогидразы не связано с жизненными процессами в клетках. Она устойчива к прямому окислению и не разрушается микробами. Работа азогидразы продолжается после распада клеток, повидимому, в течение длительного времени.

4.         Эта непрекращающаяся активность может повести к накоплению- аммиачного азота в количествах, больших, чем те, которые могут быть усвоены клетками азотобактера.

5.         Продукция аммиака интересна с экономической точки зрения, так как при этом образуются относительно большие количества его, в резульг тате потребления очень небольших доз питательного вещества.

Все эти заключения, полученные при помощи опытов на наших пластинках из кремнекислого геля, полностью приложимы к почве, которая является минеральной средой, бедной питательными веществами, повидимому, того же самого состава, как те, которыми мы пропитываем наш гель. Таким образом, есть основание считать, что азотобактер, развивающийся в почве повсюду около разлагающихся растительных остатков, делает ее способной черпать из воздуха молекулярный азот при помощи восстановительного процесса. Можно предполагать, что определенная степень плотности клеток азотобактера в почве и даже их присутствие в активном состоянии не необходимы, для того чтобы эта деятельность могла осуществляться. Достаточно спорадического, происходящего* периодически развития азотобактера в различных пунктах определенного участка почвы, чтобы азотфиксация могла в дальнейшем поддерживаться в почве, так как «выживаемость» катализатора неизмеримо- выше выживаемости клеток микроорганизма.

Та же самая способность должна наблюдаться й в водах, бедных азотом, являющихся обычным местом обитания некоторых видов водных азотфиксаторов — азомонад.

Происходит ли, в случае симбиотической фиксации азота, аналогичный процесс? Было бы преждевременно это утверждать. Однако факт выделения аммиака отделенными от растения клубеньками, особенно после того, как их растирают в порошок, в условиях, близко напоминающих опЫ~ ты с азотобактером, заставляет склоняться к мнению, что здесь проц идет в основном одинаково, за исключением фазы дегидрирования ее субстрата.        й

Упомянем, наконец, об анаэробной фиксации азота, изучение К0Т(ХН_ не сделало больших успехов со времени исследований 1885 г. [14 Ь ос°са но в том, что относится к ее роли в природе. О сущности самого ^ни0 известно лишь, что фиксация может осуществляться при проп> газообразного азота через среду, где происходит брожение с выделением водорода. Надо согласиться, что гидрогенизация молекулярного азота в этих условиях представляется вполне вероятной.

Все эта сопоставления поддерживают гипотезу, что один и тот же восстановительный процесс лежит в основе всех известных случаев биологической фиксации азота, возбудителями которой являются микроорганизмы.

 

 

 

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ

 

 

Последние добавления:

 

Ферсман. Химия Земли и Космоса

 

Перельман. Биокосные системы Земли

 

БИОЛОГИЯ ПОЧВ

 

Вильямс. Травопольная система земледелия

 

История русского почвоведения

 

Качинский - Жизнь и свойства почвы

 

Вернадский - ЖИВОЕ ВЕЩЕСТВО