ИССЛЕДОВАНИЕ СИМБИОТИЧЕСКОЙ АЗОТФИКСАЦИИ

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

ИЗУЧЕНИЕ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ

В сотрудничестве с Еленой Виноградской

Исследования клубеньковых бактерий бобовых растений составляют одну из наиболее блестящих глав агробиологии. Они являются и наиболее обширными. Библиография содержит более 1000 названий.

К счастью, хорошая монография «О клубеньковых бактериях бобовых», в которой Фред, Болдуин и Мак-Кой   представили полную картину состояния этого вопроса до 1932 г., избавляет от необходимости делать исторический обзор за длительный период исследований.

После классических работ Гелльригеля и Вильфарта, а также Бейе- ринка, за последние сорок лет, благодаря усилиям большого числа выдающихся ученых-агрохимиков, микробиологов, ботаников,— возникла обширная литература, посвященная изучаемому вопросу. Если в нескольких словах подвести итог этих работ, то их основная заслуга состоит в детальном освещении взаимоотношения высшего растения и клубеньковых бактерий, а также в показе того, что конечным результатом этого симбиоза является фиксация атмосферного азота. В чем мы были менее счастливы, так это в изучении всего, что касается механизма этого явления. Здесь существовал общепризнанный пробел, который до настоящего времени невозможно было заполнить; больше того, здесь ощущается нечто вроде кризиса, вызванного сомнением в уже достигнутых, казалось, результатах.

Сначала была тенденция видеть в микробе-симбионте азотфиксатора, от которого растение получает выгоду. Выделенные в чистую культуру бактерии казались способными к азотфиксации. По опытам, датируемым с конца XIX века и до 1902 г., они даже давали значительную прибыль фиксированного азота. В последующих исследованиях уже были вынуждены довольствоваться гораздо более скромными прибавками азота, однако признавали их достаточными, чтобы продолжать считать изолированных клубеньковых бактерий азотфиксаторами. Бывали и отрицательные опыты, и что поражало, так это диспропорция между прибавками азота в ранних работах и в последующих. Это объяснялось нечистотой первых культур* которые могли быть загрязнены маслянокислым микробом — Clostridium> способным, как известно, к азотфиксации.

С этой точки зрения Бартель   пересмотрел вопрос. Он культивировал клубеньковые бактерии гороха в колбах Кьельдаля, соединенных в одну систему, предохраненную от загрязнения, и принимал все меры для контроля за чистотой культуры. За 40 дней он не получил никакой прибыли азота.

С этого момента внимание было привлечено к методике определения азота по Кьельдалю и ее модификациям. Можно ли делать заключение о прибыли азота по разнице между результатами параллельных определений азота по методу Кьельдаля в опыте и в контроле?

Гопкинс   показал, что при употреблении модификации Кьельдаля- Гуннинга, которой пользуются для определения азота в субстратах, содержащих нитратный азот, потери азота при сжигании не предотвращаются. Эти потери, очевидно, не происходят, если азот предварительно восстановлен смесью Деварда по методу Дэвиссон-Парсона. Громадное количество сравнительных определений, произведенных автором (до 500), делает это несомненным. Во время анализа только контроль теряет некоторое количество нитратного азота. В культуре же этот азот быстро усваивается и обусловливает прибыль в пользу культуры, что по существу является лишь отсутствием потери.

Что касается аммиачного азота, то Мария Лёнис   показала, что он может улетучиваться при длительном выдерживании в термостате (30—40 дней) слабо щелочных питательных сред. Здесь снова только стерильная среда — контроль — теряет азот, тогда как в заселенной среде этот азот немедленно входит в состав клеток, тем более быстро, что он всегда бывает в недостаточных количествах.

Учитывая эти данные, Аллисон  , последний, или один из последних 55 исследователей, занимавшихся этим вопросом, поставил небывалое количество опытов: 600 определений приведены в его работе, и еще несколько сот он не счел необходимым приводить. Ни в одном случае его опыты не позволили заключить, что Rhizobium способны фиксировать атмосферный азот, развиваясь вне высшего растения.

Такой внушительный результат, абсолютно отрицательный, является этапом в изучении этого .вопроса: мы вынуждены отказаться от положительных результатов, полученных большинством (34 из 55) исследователей, и признать их ошибкой анализа.

Если это так, то клубеньковые бактерии в чистой культуре, так же как и одно растение без бактерий, не способны к азотфиксации, которая идет только в симбиозе. К тому же следует сказать, что все исследования, проведенные в течение полувека, не смогли разъяснить процесс азотфиксации. Что же касается химической природы этого процесса, то по механизму азотфиксации у азотобактера есть некоторые интересные данные, но по сим- биотическим бактериям еще ничего неизвестно. Загадка остается неразгаданной.

Следует ли считать твердо установленной неспособность чистых культур клубеньковых бактерий фиксировать азот? Конечно, нет, так как ее всегда можно объяснить нашим незнанием каких-то особых условий, без которых процесс не идет. Весьма возможно, что растение снабжает своего симбионта не только известными микробиологу энергетическими и пластическими веществами, но и еще чем-то, не известным пока микробиологу, — энзимом или коэнзимом. В этом направлении и следует вести исследования.

В настоящее время, на наш взгляд, задача заключается не в увеличении числа опытов, а в варьировании их, в отходе от проторенных путей в поисках новых методов. Что сейчас крайне необходимо — это добиться большей тонкости в анализах, чтобы тем самым иметь возможность доверять тем маленьким различиям, которые обычно считают малопоказательными так как они почти не превосходят погрешности опыта. В случае, когда дело идет об обнаружении способности, проявляющейся в очень слабой степени под влиянием неблагоприятных условий, эти маленькие разницы могут быть весьма показательны при условии, что они регулярно положительны и их величина достаточно постоянна. Это заставляет нас придавать им значение, видя в них проявление способности к азотфиксации, находящейся в скрытом состоянии.

Во всяком случае, оставляя вопрос открытым, мы попытались найти методику простую и быструю, и в то же время достаточно точную, чтобы надежно определять количества азота порядка нескольких микрограмм. Она подробно описана в настоящем сообщении, так же как и первые полученные результаты.

Далее мы перейдем к явлению, на которое до сих пор не обращалось должного внимания: выделение свободного аммиака клубеньками, что и является содержанием настоящего сообщения.

Мы придаем этому явлению весьма большое значение, так как видим в нем ключ, который позволит расшифровать механизм симбиотической азотфиксации, до сих пор еще совершенно неизвестный.

Наши первые наблюдения относятся к 1933 г. Они были изложены в сообщении Академии Наук на заседании 17 июля 1933 г.

ОПЫТЫ ПО ФИКСАЦИИ АЗОТА

Большинство опытов по азотфиксации ставилось на жидких средах, объемом 50—100 мл, которые выдерживались в термостате от 20 до 40 дней, затем выпаривались и подвергались анализу по макрометоду Кьельдаля.

Мы изменили методику: употреблялась исключительно твердая среда, для анализа брался минимальный объем, допустимый для подобных опытов. Сокращалась доза сахара до сотни миллиграмм, чашки выдерживались в термостате не более четырех дней, и эти маленькие пластинки твердой среды подвергались анализу по микрометоду Кьельдаля.

Применялись чашки Петри, диаметром 5 см, из стекла Пирекс, наполненные кремнекислым гелем, пропитанным питательными солями и глюкозой в количестве 100—130 мг.

Дозировки азота (в миллиграммах) применялись следующие:

0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0.

В качестве источника азота применялись различные азотистые вещества в виде растворов с точно известной концентрацией. Количество раствор > соответствующее вышеприведенной шкале, выливалось на чашку при помощи прецизионной пипетки.

В качестве посевного материала применялись культуры, выделенные из молодых клубеньков гороха, фасоли, бобов, люцерны и клевера, которые поддерживались на желатине с отваром из листьев гороха. Для посева употреблялись только пышные 2—3-дневные разводки.

После посева чашки помещали в герметически закрытый сосуд (мы пользовались эксикатором), предохраненный от загрязнений, находящихся в воздухе, промывательным сосудом с серной кислотой. Контрольные чашки немедленно помещались под колокол рядом с большим тампоном, пропитанным хлороформом, где они и оставались до анализа.

Культура выдерживалась при температуре в 30° четверо суток; срок этот вполне достаточен, для того чтобы было потреблено небольшое количество внесенного сахару, при условии даже немного замедленного роста.

Для анализа (определение количества сахара и общего азота) чашки заливались кубиком iV/10 соляной кислоты, высушивались при 40°; высушенный гель собирался в колбы для определения по микрометоду Кьельдаля вместе с промывными водами, и азот определялся по методу Прегля; для перегонки пользовались прибором Вагнера, снабженным кварцевой трубкой. В тех случаях, когда производилось определение сахара, применялся метод Бертрана.

Напомним несколько деталей техники приготовления чашек с кремнекислым гелем. Делают смесь равных частей соляной кислоты 13' Боме и раствора чистого кремнекислого натрия 9° Боме (удельный вес 1,07); эту смесь разливают в чашки по 10 мл; после того как гель застынет, чашки промывают до исчезновения хлора; эти чашки (которые можно хранить по нескольку месяцев) непосредственно перед опытами погружают в баню с кипящей водой не более чем на 30 секунд, чтобы не повредить поверхность геля. Гель пропитывают 0,5 мл обычного солевого раствора и таким же количеством раствора глюкозы, содержащего около 100 мг ее (точность дозировки проверяется при анализе контроля). Затем, если требовалось, добавляли дозу азота в таком же маленьком объеме. Для испарения жидкости чашки ставили на металлическую пластинку в термостат Ру (50°). Посев производили минимальным количеством бактериальной суспензии, достаточным для увлажнения всей поверхности среды. При таком посеве вся поверхность покрывалась слизью через 15—20 часов. По ходу развития и в конце делали микроскопические исследования. Те чашки, которые оказывались загрязненными, что случалось редко, устраняли. Для анализа кусочки геля переносили в колбу, что легко удается без потерь, но ополаскивание чашек, испачканных высохшими следами слизи, требует некоторого старания; это делается при помощи палочки с каучуком на конце. Для промывания достаточно 5 мл дистиллированной воды. Для сжигания берут 1,5 см3 серной кислоты (марки «для Кьельдаля»). Дистиллят улавливается N/100 соляной кислотой, оттитровывается iV/100 содой с метилкрасным в качестве индикатора. Подробности можно найти у Прегля , методике которого мы точно следовали.

Чтобы проверить, не происходит ли потерь азота при описанной методике, мы приготовили раствор хлористого аммония, содержащий точно — насколько это возможно — 1 мг азота в миллилитре. 1 мл при помощи прецизионной пипетки вливали прямо в аппарат Вагнера. Еще 1 мл предварительно выливали на чашку с гелем, который затем дополнительно подкисляли, высушивали, высушенные кусочки и промывные воды переносили в колбу для сжигания по микрометоду Кьельдаля, и оттуда в аппарат для перегонки. Найдено:

Азот, мг         Азот, мг

Прямое определение           Определение в чашках

Первое            0,9835            Первое .... 0,9555

Второе            0,9905            Второе .... 0,9485

Потери, как можно видеть, незначительны и они имеют тем меньшее значение, что быстрота методики позволяет вводить в опыт большее, чем обычно, количество контрольных определений, которые отмечают погрешность методики для всех вариантов опыта.

Ожидая незначительных результатов, необходимо было составить себе представление о порядке величин той положительной разницы, которую следует считать показателем способности фиксации азота. Для этого необходимо было сделать пробу со штаммом азотобактера, проводя опыт в тех же условиях.

Чашки, диаметром в 5 см, с кремнекислым гелем, пропитывали глюкозой в количестве 115 мг. К контрольным чашкам добавляли хлороформ. Опыт длился четыре дня в термостате.

Если отнести прибыль азота к 1 г глюкозы, как это обычно делается, получается величина 6,8. Эта величина минимальная. Чаще на глюкозе и манните это отношение поднимается до 10 мг. Опыт свидетельствовал скорей о прибыли-минимуме и именно поэтому можно было не делать предварительного испытания для решения вопроса о том, достаточно ли четырех дней для этого штамма, чтобы полностью использовать дозу сахара.

От 5 до 8 > на чашку

+ 50 — 25 + 25 + 158

8 дней 7,5

16 » 15 21 день 20

Можно заключить, без риска ошибиться, что способность азотфиксации достаточно выражена, если в таких условиях прибыль азота достигает 700—800 микрограммов на 100 мг глюкозы.

Всего до нынешнего дня было поставлено 14 серий опытов, результаты которых вкратце мы здесь приводим, группируя их таким образом, чтобы получить ответ на интересующие нас вопросы.

I.          Способны ли клубеньковые бактерии фиксировать азот на среде, лишенной связанного азота? Способны ли они размножаться, потребляя сахар?

В табл. 1 приведены все данные, касающиеся этой серии чашек. Разница в содержании азота между опытом и контролем выражена в микрограммах (у) и обозначена + и —. Цифры в первой серии относятся к каждой чашке в отдельности. В четырех следующих даны средние из всей серии. Шестая серия выдерживалась гораздо дольше, чем обычно, чтобы проследить, как идет потребление сахара во времени. Определение сахара проводилось в первом случае через 8 дней, во втором через 16 дней и в третьем — через 21 день.

II.        Усиливает ли азотфиксацию связанный азот, добавленный в более или менее недостаточном количестве, от 0,5 до 2,0 частей на 100 частей сахара? Какая форма азота дает наилучший эффект: аммиачный азот, амид- ный или аминный, или белковый?

2.         Азот аммиачный, амидный или аминный, а также и белковый, усиливают размножение, как это давно известно. Культуры обильно вырастают и потребление сахара значительно увеличивается. Оно точно зависит от дозы азота: при 0,5 мг азота потребляется около 50 мг сахара, 1,5- и 2,0 мг достаточно для разложения всего начального количества в 100— 130 мг. Но это более пышное развитие не сопровождается более активной фиксацией. Наоборот, все культуры в этих сериях опытов показали отрицательные разницы между контролем и опытами и эти отрицательные величины были так же постоянны, как были постоянны положительные в первых сериях опытов. Весьма возможно, что это объясняется дезаминирова- нием, которое вызывают бактерии, но необычным является то, что оно происходит при недостаточных количествах азота.

3.         Азот органических экстрактов — дрожжевой воды, отвара листьев и экстракта из корней — обусловливает весьма обильное развитие культург что также известно. В присутствии этой формы азота потребление сахара идет лучше. Что же касается фиксации азота, то положительные разницы постоянно наблюдаются в этих сериях опытов. Однако они никогда не достигают того порога, который характеризует подлинную фиксацию.

Эти опыты, пока еще не завершенные, показывают нам то направление,, в котором следует вести исследования, а именно, искать в частях растения, особенно в корнях и клубеньках, энзимоподобные вещества, способные активировать фиксацию.

ВЫДЕЛЕНИЕ АММИАКА КЛУБЕНЬКАМИ

Кажется, что до настоящего времени вопрос о выделениц аммиака клубеньками оставался вне поля зрения исследователей. Так, нам не удалось найти в литературе ни малейшего упоминания о свойствах клубеньков. Мы не случайно обратились к исследованию клубеньков — наше внимание привлекла аналогия с азотобактером. Любопытная особенность — выделение аммиака при развитии на среде, совершенно лишенной связанного азота,— одним из нас была поставлена в зависимость от фиксации азота. Аммиак рассматривался как первичный стабильный продукт синтеза, который может выделяться во внешнюю среду в тех довольно частых случаях, когда происходит нарушение равновесия между процессом восстановления азота и ассимиляцией продуктов синтеза клеткой. Если даже не настаивать здесь на этой, пока еще спорной теории, понятно, насколько интересны поиски аммиака в случае симбиотической фиксации, химическая природа которой до настоящего времени совершенно не изучена.

Культуры клубеньковых бактерий не выделяют аммиака в среде, лишенной азота. Но, как мы уже видели, они и не обладают достаточно подтвержденной способностью к фиксации; по аналогии казалось вполне естественным обратить внимание на органы симбиотической фиксации — на корни, снабженные клубеньками, и в особенности на самые клубеньки служащие, как известно, очагами довольно интенсивной фиксации.

Заметим, что роль этих симбиотических органов обычно представляли себе таким образом, что клетки бактерий, растворяясь, отдают свой азот высшим растениям. Мы не отрицаем этого позднего лизиса, но явление открытое нами, приводит к совершенно иному представлению о роли этих органов в азотном балансе растения и — само собой понятно — в окружающей среде.

Выделение аммиака клубеньками и корнями, снабженными клубеньками, довольно легко наблюдать. Оно было замечено нами во время первых опытов весной 1933 г., о чем и было сообщено в нашем докладе Академии Наук на заседании 17 июля.

Клубеньки, отделенные от корней, помещались в чашки Петри, величина которых зависела от количества клубеньков. Так, мы брали совсем маленькие чашки, диаметром в 3 см, в тех случаях, когда располагали 1—2 дюжинами клубеньков; для 0,5—1,0 г клубеньков брали 5-сантиметровые чашки; в тех случаях, когда брали несколько граммов клубеньков, использовались 10-сантиметровые чашки. На внутренней поверхности крышки укреплялась полоска розовой лакмусовой бумаги, смоченная водой. Для опыта употребляли чувствительную светлорозовую лакмусовую бумагу, способную отметить все переходы к красно-фиолетовым оттенкам. Само собою разумеется, мы убеждались в том, что стекло крышки (мы пользовались преимущественно пирексом) не изменяло оттенка смоченной бумаги после длительного соприкосновения с ней. Если придерживаться всех этих условий, то изменение окраски лакмусовой бумажки быстро отмечает следы летучей щелочи в количестве порядка 10 — 5 у.

Значительно более чувствительная реакция Несслера применима для качественных определений аммиака в каплях конденсата, который образуется на внутренней поверхности крышки. Его можно получить в большом количестве, если поместить чашку на металлическую пластинку в термостат Ру и охлаждать крышку при помощи сосуда, наполненного холодной водой.

Чтобы определить количество выделенного аммиака при малых количествах клубеньков, в чашки помещали маленькие капсюльки, содержащие 1 или 2 капли концентрированной серной кислоты. Чашки ставились в эксикатор. По прошествии желаемого срока каждая капсюлька извлекалась и погружалась в 50 мл дистиллированной воды. Затем производилось определение аммиака реактивом Несслера.

Если ставить более длительные количественные опыты, удобнее помещать корни или оторванные клубеньки в промывную склянку, соединенную, с одной стороны, с колонкой, наполненной пемзой, смоченной в серной кислоте, а с другой — с сосудом, содержащим титрованную серную кислоту с индикатором. Через все эти сосуды в течение желаемого времени протягивается воздух. Для оторванных клубеньков часто удобнее пользоваться маленьким эксикатором. В тех случаях, когда желательно предотвратить высыхание материала, между колонкой и сосудом с исследуемым объектом помещают промывную склянку с водой. Для очищения воздуха можно использовать концентрированный раствор щавелевой кислоты.

Соблюдая эти простые условия, можно протягивать воздух в контроль^ ном опыте в продолжение неограниченного количества часов, не оонару живая ни малейшего изменения титра титрованной кислоты в промывател - ной склянке. В контрольных опытах мы протягивали воздух безостановочн продолжение 3—4 дней. В промывательной склянке с титрованнои кисло содержалось всего лишь 2 мл сантинормальной кислоты. Титр изменялся не более чем на 0,1 мл. Эта разница легко могла быть замечена на микробюретке, градуированной на 0,05 мл.

Обычно, когда происходило изменение окраски индикатора, приходилось добавлять новые порции титрованной кислоты. Если окраска не менялась, кислота оттитровывалась. Вообще, количество кислоты бралось с таким расчетом, чтобы ее хватило на длительную аэрацию. Поэтому определение аммиака шло до некоторой степени автоматически и не требовало особых забот.

Начиная с мая 1933 г., было проведено очень большое количество опытов и определений аммиака; выделение аммиака всегда подтверждалось. Конечно, явление, которое зависит от многих условий, не может протекать всегда одинаково. Может случиться, что оно отсутствует или что его трудно вызвать. Но такие случаи редки. Выделение аммиака — довольно общее явление среди бобовых — речь идет о горохе, фасоли, бобах, клевере (с люцерной опыты не ставились). Для опытов лучше всего брать клубеньки гороха. Их, кроме того, легче иметь в большом количестве.

Чтобы иллюстрировать нашу методику, приведем подробно наблюдения в течение первого часа.

Со свежевыкопанных корней гороха обрывают несколько десятков клубеньков, не повреждая их при этом. Делят их на равные порции и помещают в чашки Петри. Одну порцию клубеньков раздавливают концом стеклянной палочки, другая часть остается нетронутой. Чашки покрывают крышками с укрепленной в них лакмусовой бумажкой. Раздавленные клубеньки уже в течение десяти минут вызывают посинение бумажки. Во второй чашке изменение индикатора происходит медленнее. Через час бумажка делается фиолетовой.

В две чашки помещают по 0,5 г свежесорванных клубеньков фасоли в каждую. В одной чашке их раздавливают, в другой оставляют целыми. В третью чашку помещают корни с оторванными клубеньками, четвертая служит контролем. В каждую чашку кладут капсюлю, содержащую Л каплю серной кислоты. Чашки выдерживают под колоколом в течение 18 часов, потом производят определение аммиака по Несслеру, как описывалось выше. При этом находят следующие количества аммиачного азота в у:

Раздавленные клубеньки   

Целые клубеньки    

Корни с оторванными клубеньками

Возьмем ли мы целые клубеньки или раздавленные, мы тотчас же убеждаемся, что именно они, а не корни являются источниками выделения аммиака. Если это так, то корни злаков не должны выделять аммиак.

 Вместо корней кукурузы помещают в сосуд 52 г корней гороха с тщательно оборванными клубеньками. Протягивают воздух в течение 16 часов. Результаты титрования:

Те же корни с клубеньками            35,09

Корни без клубеньков         0,2

2. В большую промывательную склянку помещают 100 г корней гороха, отрезанных от стеблей, с большим количеством клубеньков, промытых, просушенных на фильтровальной бумаге. В маленькую промывательную склянку наливают 26 мл iV/10 кислоты и протягивают насосом воздух через обе склянки. К сожалению, выделение аммиака не было прослежено в течение первых суток. Было лишь замечено, что индикатор, добавленный в кислоту, изменил свой цвет к концу 24 часов. Протягивание воздуха продолжалось еще три дня. Каждые 24 часа производилось титрозание кислоты, и в промывательную склянку наливалась новая порция jv/10 кислоты.

Азот аммиака,

мг

Первый день  35,0

Второй день                          31,0

Третий день  18,5

Четвертый день        1,4

Можно видеть, что в этих условиях наблюдается относительно обильное выделение аммиака, и оно происходит только в присутствии клубеньков. Злаки не выделяют аммиака. Корни, лишенные клубеньков, тоже практически неспособны к этому.

Таким образом, мы вынуждены заключить, что именно органы симбиоза способны непрерывно выделять аммиак. Нельзя ли приписать выделение аммиака— частично или целиком — деятельности плесеней или бактерий- аммонификаторов?

Однако это сомнение не основательно. Корни, предварительно хорошо просушенные, все более высыхают под действием продувания воздухом, пропущенным через колонку с серной кислотой. Ни на поверхности корней, ни в окружающем воздухе нет избытка влаги, который допускал бы развитие мицелия, не говоря уже о бактериях, развитие которых невозможно без слоя влаги, хотя бы капиллярного. Действительно,тщательное исследование не показало никаких следов грибного мицелия в конце опыта. Наконец, легко убедиться, что воздействие микробов отличается совсем иным ходом аммонификации. Она начинается лишь через несколько дней инкубации при комнатной температуре, затем быстро нарастает, достигает гораздо большей величины и прекращается только после глубокого разрушения вещества, подвергавшегося микробному воздействию. Если даже процесс гниения и не дошел до конца, то не надо быть микробиологом, чтобы отличить пораженные корни, пахнущие плесенью, от непораженных корней, сохранивших свой обычный вид, и, кроме того, запах, столь характерный.

Тем не менее, совершенно ясно, что вмешательство микробов является постоянной угрозой в течение этих опытов, как и вообще во всех энзима- тических исследованиях. Далее можно будет видеть типичный пример того, как это вмешательство проявляется.

Применение антисептиков было, очевидно, необходимо, когда дело шло о продолжительных опытах. Преимущественно применялся хлороформ и толуол. Далее представлены два длительных опыта.

начале ноября, отрезанные от стебля, высушенные при 40° в течение одного дня и сохранявшиеся в сухом виде. На них было много мелких сморщенных клубеньков. Несмотря на это, проба с лакмусовой бумажкой была положительной. Корни в количестве 40 г помещали в промывательную склянку, соединенную, с одной стороны, с колонкой с пемзой, смоченной серной кислотой, а с другой — с маленькой промывательной склянкой, содержавшей 0,5 мл iV/50 кислоты, разбавленной в воде. Затем мы пускали в ход насос и (по часам) наблюдали изменение оттенков метилового красного от красного

к канареечыожелтому. Тогда кислоту в промывательной склянке сменяли на новую, в таком же количестве или в большем, что производилось несколько раз в день в течение восьми, реже пятнадцати дней.

2. Опыт с продуванием был поставлен таким же образом, только было взято лишь гит корней и хлороформ заменен толуолом. Антисептик наливали на дно сосуда ' чтооы не замочить корней. В табл. 5 и на 82 представлены все детали опыта.

Как можно видеть, ход выделения аммиачного азота во втором опыте совсем иной, чем в первом. В первом опыте выделение аммиачного азота, хорошо заметное в первые дни, несмотря на то, что корни были почти сухие, становится все более интенсивным по мере увлажнения протягиваемого воздуха после добавки небольших количеств воды. Хлороформ не приостанавливает выделения аммиака, так как можно видеть, что кривая у/мин. достигает наивысшей точки в атмосфере, уже насыщенной хлороформом. Это значительное выделение аммиака продолжается три-четыре дня, а затем-резко падает, но остается еще заметным дней пятнадцать. Возможно, что хлороформ в конце концов убивает или уменьшает активность энзиматических систем, вызывающих это явление.

Во втором опыте выделение аммиака менее обильно, что частично объясняется вдвое меньшим количеством корней. Оно повышается в течение двух первых дней и падает в течение трех последующих до ничтожной величины. Затем кривая быстро поднимается до максимальной величины y'/мин. Это возобновление активности объясняется просто микробным заражением. Мы приводим этот случай, чтобы показать, как проявляется это вмешательство микробов. Толуол, возможно, лишь несколько задержал заражение, но не предотвратил его. Толуол хорошо применять в опытах с энзимами, когда он добавляется в жидкость, омывающую вещество, но действие его паров недостаточно, чтобы предотвратить размножение микробов. Исследование корней подтвердило это заключение.

В тех случаях, когда хотят измерить выделение аммиака у клубеньков, отделенных от корней, их помещают в небольшую колбу типа, применяемого при микрометоде Кьельдаля, или в маленькую пробирку, которую опускают в промывательную склянку, или, наконец, в тигель, помещенный в небольшой эксикатор. Во всех случаях конец трубки, через которую входит воздух, должен быть погружен в массу клубеньков. Это делается для того, чтобы вентиляция была более эффективной. Для этой же цели бывает полезно подогреть сосуд на водяной бане или другим способом до 40—50°.

Вот ход нескольких количественных опытов этого типа.

Клубеньки гороха, вырытые при очень сухой погоде, освобождались от земли без промывания. В две пробирки помещали по 5 г свежих клубеньков В одной из пробирок клубеньки раздавливали стекляпиой палочкой и увлажняли толуолом. В другой пробирке клубеньки оставляли целыми и толуола не добавляли. Пробирки опускали в промывательные склянки, которые присоединяли к вентиляционному устройству. Насос пускали в ход в продолжение 18 часов и затем определяли выделившийся аммиачный азот.

Раздавленные клубеньки с толуолом        9?52

Нормальные клубеньки       7?87

Простые количественные опыты при помощи лакмусовой бумажки делались постоянно в течение сезона. Маленькие порции клубеньков гороха, фасоли и бобов, взятые даже в момент снятия урожая, помещенные в чашки Петри, почти неизменно вызывали быстрое и заметное изменение окраски лакмусовой бумажки. Иногда начало изменения окраски появлялось уже через 10 минут и бумажка синела через 20 минут при комнатной температуре. Иногда же изменение окраски происходило так быстро только в том случае, если чашки помещали на металлическую пластинку, нагретую до 40°. Наконец, во многих случаях изменения окраски приходилось ждать от получаса до часа даже тогда, когда чашки стояли на теплой пластинке, причем бумажка становилась не голубой, а фиолетовой. В этих сомнительных случаях проба с реактивом Несслера подтверждает, что все-таки происходит выделение аммиака.

Как бы ни была маловероятна мысль о немедленном вмешательстве микроорганизмов, мы все-таки исследовали действие различных антисептиков на изолированные клубеньки.

Краткая обработка сулемой по методу, которым пользуются для поверхностной дезинфекции клубеньков при выделении клубеньковых бактерий, нисколько не подавляла изменения окраски лакмуса. Точно так же не прекращал выделение аммиака тимол в порошке, смешанный с клубеньками.

Казалось удивительным, что выделение аммиака можно было наблюдать не только у свежесорванных клубеньков в почти нормальном состоянии, но и у клубеньков, высушенных на воздухе и при 40°. Легко приготовить запас, который хранится в закрытом сосуде. В нашем распоряжении было свыше 20 г клубеньков от 1933 г., многократно использовавшихся для опытов с изменением окраски лакмусовой бумажки и постоянно с положительным результатом. Последний раз этот опыт был повторен в момент, когда пишутся эти строки (январь 1936 г.). 10 г клубеньков, помещенных в чашку Петри, диаметром 10 см, с лакмусовой бумажкой, вызвали изменение окраски, начавшееся через 15 минут на теплой пластинке и почти закончившееся по истечении часа. На холоду изменение окраски только начиналось, но не завершалось.

Кажется необычным, что эти органы, столь обедненные водой, являются местом, где происходит образование аммиака. Вода, содержащаяся в них, может быть только гигроскопической или химически связанной. Правда, клубеньки, как и корни, на которых они находятся, жадно поглощают воду. Если поместить в воду сухие клубеньки, совершенно сморщенные, они набухают почти мгновенно и принимают нормальный вид. Если их поместить в закрытую чашку в присутствии влажной фильтровальной бумаги, то они ее высушивают подобно хлористому кальцию. Если клубеньки высушить при 40° в течение 10 часов, охладить в эксикаторе и тут же взвесить, а затем 5—6 дней подряд продержать на столе в лаборатории, то можно обнаружить увеличение веса в среднем на 10% по сравнению с первоначальным.

Еще следует указать, что клубеньки, вынутые из термостата и немед ленно употребленные в опыт, кажутся потерявшими активность. Нельз обнаружить ни изменения окраски лакмуса, ни положительной реакци с реактивом Несслера. Интересно, что в этом состоянии они теряют свой характерный запах. Их вещество кажется окончательно «мертвым». Но если их повторно выдерживать под влажной фильтровальной бумагой, то можно заметить своего рода «пробуждение активности». Более быстро можно вызвать это пробуждение, если слегка сбрызнуть клубеньки водой из пульверизатора.

Если предположить,, что интересующее нас свойство клубеньков связано не с структурой тканей, а лишь с биохимическими свойствами, то естественно было превратить их в однородную массу, размолов в порошок. Сухие клубеньки, размолотые в мельнице с прокаленным песком, легко превращаются в мельчайший коричневый порошок, с сильным запахом. С этим порошком опыты получаются еще яснее. Достаточно небольшого количества, 1 г этого порошка, чтобы воспроизвести все опыты неограниченное число раз. Чтобы активизировать выделение аммиака, достаточно добавить щепотку карбоната магния и небольшое количество двуосновного фосфорнокислого калия. С этим небольшим количеством вещества мы получали наиболее блестящие результаты.

Несколько чашек, диаметром 5 см, с порошком хранились в течение многих месяцев и периодически применялись для опытов. Результаты всегда были положительными, но интенсивность сильно менялась. Основную роль играет вода. После длительного высушивания выделение аммиака ослабевало еще в большей степени, чем это наблюдалось у клубеньков, но оно возобновлялось после «отдыха» в течение нескольких дней. Под воздействием увлажнения оно быстро восстанавливалось. Каждый раз после опытов порошок высушивался в течение 10 часов при 40°. Активность его не терялась после такого воздействия.

Чтобы показать, что выделение аммиака измеримо как с высушенным порошком, так и с влажным, приведем в качестве примера три следующих опыта.

1. Порошок, высушенный на воздухе,—1 г клубеньков, растертых с прокаленным песком,— насыпался в открытую чашку Последняя ставилась в маленький эксикатор и*через него протягивался воздух.

2.         Порошок в том же количестве после целой серии опытов высушен и, казалось, потерял активность. Больше не дает изменения окраски лакмусовой бумажки. При протягивании воздуха, титр кислоты почти не изменяется:

на 2,0 кислоты 7V/100 идет 1,95 щелочи.

К порошку добавляют 2 мл дистиллированной воды с десятью каплями толуола.

Масса превращается в твердую корку, которая больше не изменяет титра кислоты. Растертая, она вновь изменяет цвет лакмусовой бумажки.

3.         Вновь берется порошок (пз опыта 1), который хранился в высушенном виде в течение 6 недель.

Таким образом, масса не потеряла акгивности: после трехдневного «отдыха» она снова вызывает изменение цвета лакмусовой бумажки.

Вот, следовательно, вещество, которое кажется в некотором роде неисчерпаемым с точки зрения образования аммиака, разумеется, если с ним обращаться осторожно, как с препаратом фермента. Как же следует понимать все эти необычные факты? Мы попытаемся проанализировать это при обсуждении результатов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Первый и основной вопрос о природе описанных фактов заключается в следующем: является ли выделение аммиака нормальным физиологическим процессом, или это патологический процесс, дезорганизация работы ферментов— свидетельство смерти клеток?

Конечно, это явление мы наблюдали на изуродованных органах. Но всегда выделение начиналось немедленно, поэтому трудно представить себе, что это результат глубокого разрушения. Его ход свидетельствует о том, что это скорее нормальный процесс, чем результат повреждений.

Исследования Виртанена и Хаузена   подтверждают эту точку зрения, хотя в них и не ставилась эта цель. Эти авторы несомненно не знали о сообщении одного из нас в «С. R. Ac. Sc.» за 1933 г., так как они о нем не упоминают. Их опыты были поставлены с растениями гороха в стерильном песке, которые поливались солевым раствором, лишенным азота. Среда была заражена соответствующими клубеньковыми бактериями. В различные периоды развития растений — перед цветением и после него, потом при созревании — определялся азот в воздушных частях, а также в песке, где находились растения. В трех сериях опытов неизменно обнаруживалось обогащение песчаной'среды азотом в результате развития растения и в зависимости от него. Прибыль азота бывала различной, но содержавшееся в песке количество азота точно соответствовало количеству азота в растении. Вот, например, несколько цифр, заимствованных из таблицы авторов:

Азот, мг

Перед цветением:

Растения        50,0

Песок 66,8

После цветения:

Растения        • . . 96,2

Песок 90'6

Перед созреванием:

Растения        143,4

Песок 99'7

Подобного же рода эксперименты были поставлены с солевым питатель- _ ным раствором и агаром. В жидкой среде выделение азота было очень слабым, порядка 1—2 мг. В агаре более заметно — от 13,7 до 18,3 мг. Однако в последнем случае сами растения были более слабыми.

Роль бобовых для повышения плодородия — понятие классическое, известное с древности. Заслуга финских авторов состоит в том, что они обнаружили непосредственный переход в почву значительной части азота фиксированного растением в симбиозе с бактериями из атмосферы, причем в условиях нормального развития.

Какова природа связанного азота, выделяемого растением? Авторы думают, что это аминокислоты. Попыток определить аммиак не было сделано, авторы об этом не говорят ни слова. Аминокислоты синтезируются непосредственно при процессе фиксации молекулярного азота. Дословно: «По нашему мнению, выделенные азотистые соединения являются аминокислотами, которые непосредственно синтезируются при фиксации азота» (стр. 287).

Будем считать доказанным в этой интересной работе тот факт, что связанный азот переходит из живого растущего растения в окружающую среду в течение всего периода развития до созревания. Можно сомневаться, однако, что аминокислоты выводятся как обычный продукт выделения. Является ли это чем-то вроде кровотечения, которое растение нормально претерпевает? Эта идея затрагивается Виртаненом, который замечает, что выделение можно объяснить тем, что острые частицы песка ранят растение. Но он забывает при этом, что выделение происходит и в агаровой среде.

Если с точки зрения физиологической неправдоподобно, что растение выбрасывает аминокислоты, которые обычно считаются промежуточными продуктами при синтезе белка, то присутствие этих аминокислот в песке, если оно и подтвердится, можно объяснить иначе. Его можно объяснить деятельностью бактерий, так как не следует забывать, что если стерильная среда свободна от обычных микробов, то она обильно заселена клубеньковыми бактериями, способными, как известно, размножаться в почве и в особенности в ризосфере хорошо развитых корней гороха.

Мы можем заключить, что азотистые выделения, наблюдавшиеся Виртаненом и Гаузеном, совпадают с тем явлением, которое изучали мы: в действительности дело идет о выделении аммиака в газообразном состоянии, источником которого являются клубеньки.

Попытаемся проанализировать с точки зрения физиологии это выделение аммиака, считаемое нами обычным и нормальным в семействе бобовых, в симбиозе со специфическими клубеньковыми бактериями.

Прежде всего мы сталкиваемся с вопросом, каково происхождение азота, который столь расточительно выделяется в форме аммиака?

Симбиотические органы, как известно, богаты азотом. Анализ порошка из клубеньков, высушенного при 50° в течение многих часов и сохраняемого в эксикаторе над серной кислотой, дал следующие результаты:

Азот, мг         Азот, %

4,452   4,40

3,650   4,53

2,282   4,43

1. 101 мг порошка

2. 80 » » 3. 51,5 » »

Известно, что бобовые, как и многие другие растения, содержат мочевину. По данным Фоссе, ее содержится в среднем 0,5 г на 1 кг сухого вещества. Наличие уреазы было точно установлено как в растении, так й в

изолированных культурах клубеньковых бактерий. Легко убедиться, что этот энзим имеется и в клубеньках, если*воздействовать ими или, лучше, порошком из них на раствор мочевины.

Но это не может объяснить выделение аммиака, так как, работая с небольшими количествами материала, мы имели бы дело с ничтожными, неизмеримыми величинами. Более того, невозможно представить себе гидролиз в среде, лишенной капельно-жидкой воды.

Что касается аминокислот, наличие которых в клубеньках вполне вероятно, то современная энзимология нам ничего не говорит о ферментах, которые могли бы вызвать их дезаминирование.

Наконец, если принять во внимание, что клубеньки устроены таким образом, чтобы переживать условия азотистого голодания, обладая специальными приспособлениями для борьбы с азотным истощением, то трудно представить себе длительное и обильное дезаминирование в процессе нормального развития растения.

В итоге вопрос о природе аммиака, выделяемого клубеньками, остается открытым. Экспериментальные данные еще не позволяют сделать какое- либо заключение о его природе. Но результаты, полученные с фиксацией азота азотобактером, позволяют предполагать, что химический механизм в случае симбиотической фиксации тот же самый .

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ