Вся электронная библиотека      Поиск по сайту

 

Виноградский. МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ

ОСНОВЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

 

С.Н. Виноградский

С.Н. Виноградский

 

Смотрите также:

 

Биография Виноградского

 

Микробиология

 

Почва и почвообразование

 

Почвоведение. Типы почв

 

растения

 

Геоботаника

 

 Биографии биологов, почвоведов

Биографии почвоведов

 

Эволюция

 

Биология

 

Эволюция биосферы

 

Геология

геология

Основы геологии

 

Геолог Ферсман

 

Геохимия - химия земли

 

Гидрогеохимия. Химия воды

 

Минералогия

минералы

 

Химия почвы

 

Круговорот атомов в природе

 

Книги Докучаева

докучаев

 

Происхождение жизни

 

Вернадский. Биосфера

биосфера

 

Исторический обзор. Эта новая отрасль микробиологии берет свое начало от идей Пастера о роли «бесконечно малых» в природе. С другой стороны, несомненно, что поискам живых организмов должно предшествовать ознакомление с явлениями, которые развертываются в природе. В этом смысле важное значение имеют работы французских агрохимиков — Бус- сенго, Шлезинга и Мюнца, Дегерейна и других. Именно их исследования проблем агрохимии легли в основу решения вопросов агробиологии. В частности, открытие Шлезингом и Мюнцем биологической природы нитрификации, характерного почвенного процесса, наиболее давно известного и хорошо изученного (Буссенго), послужило исходным пунктом для исследований в развитие идей Пастера. Наше открытие возбудителей нитрификации было первым решительным шагом в этой области (1890).

 

Клубеньковые бактерии у бобовых и симбиотическая азотфиксации были открыты Бейеринком па два года раньше, чем нитрификация (1888). Эта • специальная проблема изучалась немецкими ботаниками и агрономами v в продолжение полувека. Однако это изучение развертывалось обособленно и не оказало заметного влияния на развитие агробиологических исследований.

 

Мне кажется, нельзя утверждать, что истоком интересующего нас раздела микробиологии являются работы Коха и его школы и тот период, когда из почвы было выделено большое количество видов бактерий в чистой культуре. Как известно, эти работы были осуществлены исследователями, которые не были осведомлены в вопросах агрохимии и интересовались лишь вопросами санитарии. Многочисленные исследования, исходившие из этой точки зрения, привели к представлению о плотности населения почвы методом счета колоний, вырастающих на питательной желатине, но этот метод дал обманчивые результаты для агробиологии. Действительно, эти работы способствовали совершенствованию техники, что было использовано всеми отраслями микробиологии, но не было сделано никаких серьезных попыток приблизиться к разрешению специальных проблем, касающихся динамики процессов в природе.

 

Исследования анаэробной фиксации азота и открытие первого микроба- фиксатора азота следовали непосредственно за работами по нитрификации (1893), и с этого времени стали говорить о сельскохозяйственной микробиологии. «Была ли это новая отрасль, наделенная своим собственным методом, выработанным специально для решения проблем агробиологии?... Речь идет просто о заимствовании основ, приобретенных в исследованиях по общей микробиологии» (Сообщение на Первом конгрессе почвоведов Рим, 1924).

 

Прошло 30 лет, и этот период был заполнен исследованиями по нитрификации, аммонификации, азотфиксации, по исследованию некоторых явлений разложения, по образованию углекислоты почвой и т. д. Были выделены бактериальные виды, и их морфологические и физиологические свойства изучались в чистой культуре. Излюбленной темой исследований было определение количества зародышей в различных условиях — сезонных, метеорологических, культура льных. Список бактерий, полученных в чистой культуре, быстро увеличивался, но нельзя было себе составить точного представления об их роли в природе. Сама почва, в качестве заселенной среды, резервуара энергии, а также и пути разложения растительных и животных остатков оставались вне плана работ.

 

Таково было в общих чертах состояние так называемой сельскохозяйственной микробиологии к концу второго десятилетия текущего века. Но начиная с этого времени, исследования микробиологии естественных сред быстро развивались, все более приближаясь к поставленной цели, благодаря работам агрономических экспериментальных станций. Упомянем работы Ваксмана и его школы, которые внесли биохимические понятия в представление о возделываемой почве и о других естественных средах, в представление о составе микробного населения и его суммарной деятельности в разложении веществ по всем стадиям, вплоть до образования гумуса, являющегося конечным продуктом деятельности микробов в почве. Этот вопрос основательно разбирался в капитальном труде американского ученого: «Гумус — его происхождение, химический состав, значение в природе».

Следует признать, что в совокупности все эти работы ясно наметили план новой микробиологической дисциплины. Для ее развития особенно важны те тесные взаимоотношения, которые установились между наукой о почве во всех ее частях (физико-химических и особенно почвоведческих) и агробиологическими исследованиями. Эта тенденция к научному сотрудничеству нашла свое выражение в создании интернациональной ассоциации цочвоведов, основанной на конгрессе в Риме в 1924 г.

Понятно, что микробиологи, специализирующиеся в этой области и тяготевшие к этому новому центру коллективной работы, стремились к исследованию функции подлинной микрофлоры в естественном состоянии, т. е. не измененной теми условиями, которые создаются в лаборатории, другими словами, к экологии, к исследованию в свободном состоянии в природе.

Очевидно, что чистая культура необходима для физиологических и биохимических исследований, но природа ее такова, что делает невозможными серьезные экологические исследования.

 

Принцип чистых культур. Остановимся на этом в нескольких словах. Начнем с выделения штамма из места его обитания — почвы. Эта операция часто осуществляется без достаточной заботы о свойствах вида. В трудных случаях прибегают к таким сильным воздействиям, как высокая температура, щелочная или кислая реакция, токсические дозы веществ и т. д., не заботясь о том, чтобы не повредить организму. Возникает сомнение, можно ли считать изолированную культуру идентичной по своему характеру той первоначальной форме, от которой она произошла. Что же касается коллекционных культур, хранящихся в течение многих лет и ставших таким образом культурными расами, то несомненно, они уже не сравнимы со своими дикими предками.

«М ногие из наших чистых культур являются физиологическими артефактами»,— справедливо замечает проф. А. Клюйвер.

Применение микроманипулятора не может исправить положение, так как культура, происшедшая из одной изолированной клетки, является потомством одного клона, вместо средней формы, встречающейся в природе. Микроманипулятор полезен, когда изучают диссоциацию вида, в нашем же случае при его помощи можно получить лишь такие штаммы, которые будут морфологическими и физиологическими артефактами и которые нельзя идентифицировать с природными штаммами.

Говоря о чистой культуре, не ясно ли, что отсутствие посторонних организмов и, следовательно, отсутствие соревнования, создает условия биологически неестественные. И эта чистота культуры дает экспериментатору возможность переделывать природу вида, изменять ее, используя ее потенциальные, скрытые свойства, которые, возможно, не могли бы никогда развиться без вмешательства исследователя. Эколог должен остерегаться доверять свойствам, развивающимся в чистой культуре. Он интересуется действительными, реальными свойствами. В чистой культуре устраняется наиболее важный экологический фактор, я имею в виду соревнование, так как это оно обусловливает распределение процессов, осуществляемых микробами в природе, и автоматически направляет их последовательность.

Нельзя отрицать, как мне уже возразили, что при помощи классической методики были выделены и изучены свойства возбудителей некоторых важных процессов, протекающих в почве (нитрификация, азотфиксация). Эти успехи были достигнуты, как известно, благодаря методу элективных культур, который всегда остается очень полезным и применимым в некоторых случаях. Но в общем, улучшения, привнесенные этим принципом в классическую методику, не сделали ее более пригодной для экологических исследований. Таким образом, даже в тех случаях, когда известен возбудитель процесса, метод элективных культур не может выявить причин его активности в естественной среде.

Приводимые далее 'критические замечания сделают понятными те основания, которыми руководствовался автор уже в начале своих работ по почвенной микробиологии, критикуя обычную методику исследования, непригодную к использованию без внесения в нее глубоких изменений.

Логически нетрудно представить себе те изменения метода, которые необходимо в него внести. Это следующее:

1)        отказаться от обязательных чистых культур;

2)        избегать коллекционных культур;

3)        заимствовать культуры для опытов непосредственно из природы;

4)        избегать резких воздействий на культуру в процессе ее выделения, а также культивирования на среде, к которой она не приспособлена;

5)        изыскивать подходящую среду с самого начала исследований, чтобы культивировать только на такой среде.

Оставалось убедиться, позволит ли метод, основанный на этих принципах, продвинуться вперед, избегая неясностей, всегда возможных вследствие не безупречной чистоты культур.

Отказываясь от механического выделения культур, следует рассчитывать на действие среды. Это действие должно быть достаточно подчеркнуто, чтобы вызвать самопроизвольное подавление чуждых форм, вплоть до предполагаемого очищения вида.

Самопроизвольные культуры. Этот метод культивирования в принципе применяется к видам со специфическими функциями, но может быть применен и к банальным культурам в несколько измененной форме. Он подробно описан в части шестой. Напомним его в отношении специфических микробов.

1.         Нитрозобактерии. Гель, пропитанный слабым раствором сульфата аммония и питательных солей, покрытый тонким слоем карбоната кальция или магния. Колонии выявляются в виде зон растворения слоя карбоната.

2.         Нитробактерии. Гель, пропитанный небольшим количеством нитрата натрия, покрытый слоем порошка каолина. Колонии очень мелкие (менее миллиметра, слизистые).

3.         Бактерии, разлагающие целлюлозу. Cytophaga и Cellvibrio. Гель, пропитанный небольшим количеством нитрата натрия, покрытый кружком фильтровальной бумаги или кусочком ткани. Колонии в виде ярких пятен: желтых, оранжевых, красных, с растворением клетчатки (Cytophaga) или в виде блеклых желтых пятен с буроватым оттенком без растворения клетчатки (Cellvibrio).

4.         Аэробные азотфиксаторы. Азотобактер. Гель, пропитанный слабым раствором бензоата натрия или лактата кальция и минеральными солями. Строго безазотистая среда.

5.         Анаэробные азотфиксаторы. Clostridium paste- rianum. Гель, пропитанный раствором глюкозы, лишенный связанного азота. Чашки выдерживаются в атмосфере чистого азота.

Развитие всех этих специфических колоний, очень характерных и легко отличимых, обеспечено, разумеется, если в почве имеются соответствующие организмы. Микроскопическое исследование показывает удовлетворительную чистоту; посторонние организмы, если они еще имеются, находятся в латентном состоянии. В некоторых культурах еще можно найти загрязнение,которое устраняется при пересевах. Пересевы делают только на пластинки того же состава. Все чашки засевают почвой (лучше всего мельчайшими комочками, разложенными на геле в определенном порядке), что дает возможность не только констатировать размножение специфических культур в пробе почвы, но одновременно и судить о количестве соответствующих форм и о том, представлены ли они одной . разновидностью или многими. Этим способом получают организмы непосредственно из природы в таком виде, что не требуется предварительной очистки. Когда дело идет об опытах, предназначенных для исследования их специфической активности — нитрификации, азотфиксации и т. д.,— можно не опасаться вторжения загрязнения.

Выбрав в качестве примера нитрификацию, сравним этот быстрый метод со старой методикой, применявшейся после моих работ с конца прошлого века всеми исследователями этого вопроса. Начинают с длительного ряда элективных культур — накопительных культур Бейеринка,— из них выделяют культуру на твердой среде методом разведений или при помощи микроманипулятора (как это стали применять позднее). Эти попытки требуют обычно многих месяцев и часто кончаются неудачей. Исследователь, затратив много энергии на этот неблагодарный труд, не приближался к пониманию явления в его природных условиях. Обычно речь шла лишь

об одном виде, Nitrosomonas, и наибольший интерес возбуждало его отно- / шение к органическому веществу. Не является исключением и фундаментальная работа Кингма Болтьес, замечательная своей техникой. Он имел дело с одной единственной формой, идентичной той, которая была открыта в 1890 г.; она была выделена из одной клетки в форме маленького кокка. Конечно, исследователь проявил большое искусство и в работе с выделенной культурой, которая потребовала много времени и усилий. И это, возможно, помешало ему обнаружить существование флоры нитрификаторов, состоящей из форм, хорошо различающихся по своей морфологии, экологии и по ходу специфического процесса, осуществляемого ими.

Действительно, если дело идет только об отношении этих автотрофов к органическим веществам, необходима абсолютная чистота культуры, но кажется логичным отделить этот физиологический вопрос от экологических исследований нитрификации, имеющей мировое значение.

Что касается метода чашек, предназначенных для самопроизвольных культур, то применение кремнекислого геля необходимо. Его нельзя заменить агаром, так как в этом случае не будет преимуществ, предоставляемых минеральным гелем, неизменяющимся и свободным от всяких следов связанного азота. Он дает возможность приготовить среду в высшей степени элективную и не поражаемую плесенями. Он особенно необходим для правильного проведения опытов по азотфиксации, которые требуют среды, совершенно лишенной азотистых веществ, и которые иногда необходимо бывает вести в течение нескольких месяцев. Кремнекислый гель имеет еще то большое преимущество, что он очень легко пропитывается всевозможными растворимыми веществами, которые так же легко могут быть использованы организмом, как и из жидкой среды, даже при слое геля в 20—25 см глубиной. Наконец, для анализа нужно только высушить пластинки при невысокой температуре и непосредственно употреблять полученные кусочки, растерев их, если надо, в тонкий порошок. Добавим еще, что кремнекислые пластинки гораздо благоприятнее, чем агар, для очищения исследуемых культур.

 

Микробные культуры на почве.

Прямое микроскопическое исследование почвы является частью нового метода. Оно необходимо для того, чтобы можно было применить почву как среду для микробных культур.

Эти культуры, в частности, полезны, когда дело идет о характерных формах, легко отличимых при прямом исследовании, как, например, азотобактер, Clostridium, нитчатые бактерии, грибы, актиномицеты, но они не применимы для мелких форм (кокки, мелкие палочки).

Можно культивировать обоих фиксаторов азота в почве, которая их содержала или в которую они засеяны. Это наиболее чувствительный метод, чтобы судить об их присутствии или отсутствии в исследуемой пробе почвы.

Их можно культивировать:

Азотобактер: 1)в рыхлом слое почвы, слегка уплотненном; 2) на влажной почве в виде маленьких пластинок. В обоих случаях почва обогащается источниками углерода.

Clostridium: в почве, набитой в пробирки разной длины, диаметром 5 см, и увлажненной.

Микробиологический анализ почвы. Кроме этих групп мпкроорга- змов со специфическими функциями, почва, как известно, заселена

множеством разнообразных микробов: мелкие бесспоровые кокки и палочки бациллярные споровые формы, грибы, актиномицеты, функции которых сходны между собой или не ясны.

Невозможно проводить исследования всех этих гетеротрофных форм, не доведя их до выделения в чистую культуру. Но только прежде чем их выделить, надо посредством самопроизвольной культуры найти среду и изучить функцию, к которой они приспособлены.

Методика описана в статье IX части шестой.

Напомним ее здесь. На гель, пропитанный или смазанный различными веществами, производят посев определенной, очень небольшой порцией измельченной земли. Наблюдают день за днем, а если нужно, час за часом развитие колоний, стараясь отметить наиболее рано появляющиеся и наиболее распространяющиеся. Этот характер роста — верный признак того, что на культуру благоприятно действует предложенное вещество, так что она опережает и вытесняет всех соперников, внесенных на чашки вместе с почвой, служащей посевным материалом. Делая немедленно пересев на среду такого же состава, имеют все основания предполагать, что культура найдет там среду, соответствующую потребностям.

Этот метод селекции почвенных микробов может еще служить: 1) для исследования динамики данной почвы, т. е. способности ее микрофлоры использовать предлагаемое вещество; 2) для исследования усваиваемости некоторых веществ почвенными организмами; 3) для наблюдения за ролью грибов и актиномицетов в возделываемой почве; 4) для изучения условий деятельности азотфиксаторов в природе.

Многочисленные формы, появляющиеся на самопроизвольных культурах во время микробиологического анализа, могут быть, в случае нужды, выделены в чистую культуру с тем большей легкостью, что самопроизвольные культуры предварительно уже выявляют те вещества, к которым эти организмы приспособлены.

Обсуждение. Исследования, проведенные на основании изложенных принципов, делают понятным, что работы, ограничивающиеся физиологией и биохимией микроорганизмов, не могут нам разъяснить деятельность микрофлоры. Эту деятельность не следует представлять себе как сумму индивидуальных процессов, это — коллективная саморегулируемая работа. Дело идет об исследованиях по существу экологических, и те, кто владел классическим методом, недостаточно учитывали это. Следует воздерживаться от перенесения в природные условия поведения микробов, выделенных в лаборатории в чистой культуре. Между тем, заключения, которые дают повод для этой критики, и теперь еще с легкостью высказываются микробиологами, так что обзор с несколькими примерами мог бы быть полезен для уточнения точки зрения сторонников новой ветви экологии.

1. Известно, что количество видов, считающихся разрушителями цел^ люлозы, очень велико. Изолируют штамм, и, увидев полоску бумаги, разрушенную в результате его деятельности, полагают, что оносуществляет этот процесс в почве. Однако в очень многочисленных опытах с самопроизвольной культурой видят, что только Cytophaga и Cellvibrio разрушают волокна целлюлозы с удивительной быстротой, покрывая их и предохраняя таким образом от посторонних микробов. Позднее появляются плесневые грибы, которые покрывают всю чашку. Представляется вероятным, что так называемые «разрушители» целлюлозы могут воздействовать на волокна только в чистой культуре.

Специфичность функций обеих упомянутых групп признается всеми исследователями. Но в последней работе Стэниер считает возможным отрицать это на основании того, что он получил культуру Cytophaga на чистой глюкозе. Следует ли считать, что данный вид действительно использует глюкозу или он только потенциально способен к этому в чистой культуре? Чтобы найти ответ, основанный на эксперименте, лучше всего по нашему мнению, испытать самопроизвольные культуры, помещая комочки почвы на чашки с глюкозой и с нитратным азотом. Думаю, я не ошибусь, утверждая, что в результате многочисленных опытов можно будет убедиться, что чашки всегда будут заселены бациллами, a Cytophaga же никогда не появится. Если это так, то можно заключить, что глюкоза не является элективной средой по отношению к этой группе в почве и что питание глюкозой — лишь потенциальная способность, выявленная в условиях чистой культуры (физиологический артефакт).

2.         Перейдем к другому поучительному случаю — к азотобактеру. После того как Бейеринк его открыл, для его культивирования пользуются средой с относительно большим количеством маннита или глюкозы, часто с добавлением нитратного азота, чтобы получить возможно более обильную культуру. Но несмотря на легкость культивирования и на исключительно многочисленные исследования в течение многих десятилетий, вопрос о том, за счет каких веществ происходит азотфиксация в природе, остается неясным. Азотобактер неспособен использовать вещества, образующие растительный скелет. С другой стороны, культивирование на сахарах изменяет морфологию вида, вызывая обильное образование отклоняющихся форм, несомненно ненормальных. А в опытах с самопроизвольными культурами показано, что азотфиксаторы избегают чашек с сахарами, где они сталкиваются с сильными антагонистами. Но они являются хозяевами сред2 которые им дают худшую пищу (такую, как соли бензойной или масляной кислот, этанол, бутанол) и при условии, когда они лишены усвояемого азота, так как в этом случае антагонисты угнетены. Таким образом, два отрицательных условия — отсутствие азота и плохая пища —определяют собой активное состояние аэробных азотфиксаторов в природе, парализуя посторонних микробов (см. часть восьмую). Что касается морфологических отклонений, то применение экологического принципа показывает, что они являются своего рода гипертрофией биотипа в слишком богатой для него среде. Морфологические свойства становятся нормальными при культивировании на «бедной» среде. Таким образом, только новый метод делает возможным расшифровать условия активности азотобактера в природе.

3.         Физиологический характер автотрофов или аноргоксидантов много обсуждался в течение пятидесяти лет, истекших с момента их открытия. Позднейшие исследования показали, что некоторые из них не отвечали тем главнейшим свойствам физиологического типа, которые даны в наших исследованиях, а именно: 1) развитие на минеральной среде со специфическим неорганическим веществом; 2) существование, связанное с присутствием этого вещества, которое подвергается окислению в результате их жизнедеятельности; 3) этот процесс как единственный источник энергии, которым они располагают; 4) органическое вещество им не требуется ни для синтеза вещества их тела, ни как источник энергии; 5) они не обладают способностью использовать органическое вещество, которое они выносят лишь в очень слабых концентрациях; 6) им необходима лишь углекислота, усваиваемая в процессе хемосинтеза.

Некоторые формы автотрофов были способны развиваться без специфического минерального вещества, питаясь органическими веществами, имею- щимися в их распоряжении. Эти организмы принадлежат к смешанному физиологическому типу, их автотрофность факультативна.

Прежде всего следует заметить, что никакой физиологический характер не остается в природе неизменным, что, кроме типа с четко очерченными свойствами, можно столкнуться со свойствами ослабленными, изменчивыми переходными в некотором роде к другому типу. Это нисколько не против воречит существованию вполне автотрофного типа, который обычно находят в природе. Лучше спросить себя, может ли тип, искусственно измененный, сохраняться в нормальной биологической среде. Не следует допускать эту возможность, если только она не доказана специальными опытами. Пока можно утверждать, что пурпурные и бесцветные- серобактерии не могут развиваться без H2S вне лаборатории, так как они будут убиты свободным доступом воздуха. Истинные железобактерии не могут существовать без закисного железа, тарификаторы — без аммиака. Что касается бактерий гремучего газа, то кажется сомнительным, чтобы их гетеротрофность могла проявляться при наличии гораздо более энергичной деятельности настоящих гетеротрофов. В настоящее время следует считать, что автотрофы остаются верны своей функции в природе, и что изменения, которые их вынуждают претерпевать в пределах лаборатории, не следует себе представлять иначе чем артефакты.

Если пожелают интерпретировать эту факультативную гетеротрофность, наблюдаемую в лаборатории, как нормальное физиологическое свойство этих аноргоксидантов, то это нужно будет отнести тогда и к зеленым растениям, которые, как известно, можно культивировать на сахарном растворе в темноте. Но никому еще не пришла в голову мысль считать их ф а- культативными гетеротрофами. Их гетеротрофность возможна только в условиях достаточно трудного лабораторного опыта. У бактерий случай логически совершенно такой же, хотя и менее наглядный.

Я надеюсь, что мне удалось показать, что применение классической методики к экологии микробов в естественных средах, и именно в почве, может привести лишь к неверным, или в лучшем случае неточным результатам. Наступило время разграничить исследования физиологические и химические, с одной стороны, и исследования динамики микробиологических процессов в природе, по существу экологических, с другой. Это разделение приведет к более точным выводам и предотвратит недоразумения и критику, вызываемые столкновением различных направлений в исследованиях. С автором этих строк происходили случаи такого рода.

С другой стороны, истоки и первые шаги молодой отрасли микробиологии находились в прямой связи с развитием агробиологических и агрономических познаний. Очевидно, что эта отрасль микробиологии призвана служить науке о почве вместе с составляющими ее дисциплинами. Так как совместная работа требует огромного количества опытов, чтобы получить осязаемые результаты, мы попытались сделать этот метод возможно более простым, отбросив условные приемы, которые требуют большой работы и не приносят ей соответствующих результатов.

 

Микробиология почвы не ограничивается морфологией и физиологией микробов, так же как и биохимическими исследованиями. Ее основные^ проблемы имеют скорее экологический характер.

Функции микробов в природе регулируются соревнованием за энергетическое вещество и этот биологический фактор нельзя вполне заменить химическими представлениями.

Метод изучения реальных процессов, осуществляемых микробами в природе, должен быть основан не на исследовании поведения изолированных из природы видов, а на изучении микробных сообществ в целом, в природе.

Новый метод не имеет в виду заменить собой метод чистых культур (где последний необходим). Его следует представлять себе как дальнейшее развитие, предназначенное для углубления экологических проблем, которые классический метод не способен разрабатывать.

 

 

 

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ

 

 

Последние добавления:

 

Ферсман. Химия Земли и Космоса

 

Перельман. Биокосные системы Земли

 

БИОЛОГИЯ ПОЧВ

 

Вильямс. Травопольная система земледелия

 

История русского почвоведения

 

Качинский - Жизнь и свойства почвы

 

Вернадский - ЖИВОЕ ВЕЩЕСТВО