Вся электронная библиотека      Поиск по сайту

 

Виноградский. МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ

НИТРИФИЦИРУЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

 

С.Н. Виноградский

С.Н. Виноградский

 

Смотрите также:

 

Биография Виноградского

 

Микробиология

 

Почва и почвообразование

 

Почвоведение. Типы почв

 

растения

 

Геоботаника

 

 Биографии биологов, почвоведов

Биографии почвоведов

 

Эволюция

 

Биология

 

Эволюция биосферы

 

Геология

геология

Основы геологии

 

Геолог Ферсман

 

Геохимия - химия земли

 

Гидрогеохимия. Химия воды

 

Минералогия

минералы

 

Химия почвы

 

Круговорот атомов в природе

 

Книги Докучаева

докучаев

 

Происхождение жизни

 

Вернадский. Биосфера

биосфера

 

КРИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

 

Предполагается, что результаты наших старых исследований общеизвестны. Мы будем иметь случай напомнить их, рассматривая литературу предмета и, в особенности, возражения, которые были направлены против них.

 

Мы начнем с изложения работ тех бактериологов и гигиенистов, которые вновь занимались этим вопросом, придерживаясь нашего метода, и которые пришли к тем же результатам.

 

Затем мы разберем вторую группу работ, выводы которых противоречат нашим. *

Наконец, мы рассмотрим опыты и возражения агробиологов и агрохимиков, стремившихся главным образом к объяснению явлений, происходящих в почве, на основе свойств и особенностей наших микробных возбудителей.

 

Буланже и Массоль (1903—1904) в двух статьях [2], имеющих важное значение, подтверждают прежние физиологические данные, дополняя их интересными подробностями.

 

Виммер [3] в Германии (1904) в лаборатории Френкеля шаг за шагом самым тщательным образом повторяет всю программу прежних исследований, останавливаясь в особенности на трудностях выделения бактерий и на их неспособности развиваться на мясо-пептонном бульоне, питательной среде, считавшейся универсальной. Несмотря на многочисленные опыты ни одна из бактерий никогда в такой среде не развивалась; если там и появлялась какая-нибудь микрофлора, то это неизменно были посторонние формы, неспособные вести окисление ни в нитриты, ни в нитраты. Угнетающее действие органических веществ, например пептона, на нитрификацию подтвердилось. В присутствии песка угнетающее действие сказывается слабее, но все же остается несомненным.

 

Шульц-Шульценштейн [4] сообщает (1903), что ему удалось выделить из кокса биологических фильтров в Шарлоттенбурге нитрифицирующую бактерию, точно соответствующую Nitrosomonas. Никакого другого .активного организма найти там не удалось.

 

Гарриэт Чик [5] (1906) изучает нитрификацию и ее возбудителей, как факторов очищения сточных вод. Условия биологических фильтров продолжительного действия воспроизведены при помощи трубок, длиною от одного до двух метров, заполненных коксом. Будут ли применимы в этом случае полученные (Виноградским) результаты нитрификации в почве? Будут ли возбудители обладать теми же свойствами? Отрицательная чувствительность к органическим веществам (Виноградский и Омелянский) на первый взгляд кажется автору мало вероятной, так как она находится в полном противоречии с условиями существования бактерий в сточных водах.

 

В первом опыте в фильтре начальные признаки окисления появляются только через пять недель; при этом развивается одна нитритная стадия без всякого образования нитратов, которое наблюдается не раньше чем через восемь недель; через четыре месяца сохраняется только образование нитратов. В новой, т. е. не заселенной специфическими микробами среде, процесс протекает, несмотря на наиболее полную аэрацию, точно так же, как он описан у культур в жидкой среде (Виноградский), но только в тех случаях, когда процент аммиака достаточен для того, чтобы парализовать действие нитратного возбудителя: в данном опыте этот процент равнялся 0,01s . Во второй серии опытов жидкость содержала только 0,002—0,004% аммиака, и тогда обе фазы не были так ясно разграничены и протекали одновременно.

 

В этих опытах автор не щадит усилий для того, чтобы проверить отрицательный признак — неспособность развиваться за счет органических питательных веществ, признак, кажущийся автору несовместимым с условиями, при которых возбудители проявляют активность. Из сточных вод она выделяет на желатине 40 форм, на бульоне — 70 форм: ни одна из них не обладает способностью проводить окисление до нитритов. Те же опыты повторяются для выделения возбудителя окисления до нитратов, но из 40 форм, изолированных на обычных средах, ни одна к этому неспособна. Очевидно, заключает автор, ни один из возбудителей нитрификации, против ожидания, не развивается за счет органических питательных веществ. На пластинках кремнекислого геля (способ Виноградского) ей удается выделить бактерию почти сферической формы, похожую на Nitrosomonas. Выделение Nitrobacter было достигнуто на агаре с нитритами (Виноградский).

 

Рубель в своей работе [6] (1913, 200 стр.), выполненной под руководством Омелянского, задается пелыо выделить возбудителей иит- рификации из биологических фильтров и испытать влияние на их активность различных веществ, растворенных в сточных водах. Нитрит- ная бактерия кажется ему морфологически несколько другой, чем нитрит- ная бактерия из почвы Петербурга; нитратная не отличается от Nitrobacter. Автор считает, что нитрифицирующим бактериям санитарных установок свойственна меньшая чувствительность к органическим соединениям. Но они неспособны все же развиваться за счет сахара, пептона и других органических питательных веществ.

 

Особое место занимают три имеющих большое значение статьи Мейер- гофа «Исследования над процессом дыхания нитрифицирующих бактерий», появившиеся в «Pfluger's Archiv» в 1916 г. [7].

 

Пользуясь культурами двух бактерий, предоставленных в его распоряжение Омелянским, он начинает изучение их физиологии совершенно другим методом. Он применяет технику Варбурга, которая дает возможность измерять потребление кислорода и образование соответствующего продукта окисления в энергично развивающейся культуре в течение периода времени, не превышающего нескольких часов. Метод представляет огромную ценность в том смысле, что он дает возможность отграничить процесс дыхания, приводящий в данном случае к образованию нитритов и нитратов, от процесса роста, и получить таким путем более ясное представление о свойственной этим организмам энергетике.

 

Все физиологические свойства, приписанные данным ^бактериям старыми исследованиями, были подвергнуты проверке при помощи указанного метода, в особенности, хемосинтез. Для нитратной бактерии доказательство существовало до тех пор только качественное: развитие в растворе без всяких следов органического углерода при наличии углекислоты и совершенное отсутствие всякого развития без последней. Полной аналогии этого процесса с процессом окисления до нитритов, баланс которого был установлен количественно, казалось, должно было быть достаточно, для того чтобы признать выясненным и ход окисления до нитратов; но это не помешало Бейеринку усумнитьея в наличии здесь хемосинтеза. Мейергоф приводит все возможные количественные доказательства, применяя два метода: 1) определение в культурах прибыли сжигаемого углеродад 2) калориметрические измерения. Опыты по первому методу дают отношения N : С, равные 135, 131, 146, 128, из чего явствует, заключает автор, что при окислении до нитратов это отношение также является постоянным с точностью приблизительно до 10% (Виноградский). Калориметрические измерения показали, что окисление нитритов представляет собою единственный источник энергии, которым бактерии располагают.

 

Для дыхания может служить лишь один ион N0; оно будет, таким образом, происходить только по мере диссоциации нитритов, катионы которых не принимают участия в процессе.

Дыхание немедленно реагирует на изменение парциального давления кислорода: при полуатмосфере оно понижается на 20%, при xjh атмосферы — на 43%, при Vio — на 66%, при V12 — на 80%.

Между рН 8,3 и 9,3 интенсивность дыхания не изменяется; в обе стороны от этой оптимальной зоны оно быстро падает до 0.

Заметим, что такое заключение относится только к той расе бактерии, которая служила для опытов указанного автора.

Свободный аммиак, т. е. его соли в растворе с высоким рН, мешают Дыханию (Виноградский и Омелянский), и действие их усиливается по мере повышения рН.

Глюкоза, пептон, аспарагин, мочевина, парализующие рост в очень- слабых дозах, на дыхание действуют только в более сильных. Поверхностный слон плазмы молодых клеток способен, по всей вероятности, задерживать проникновение в клетку посторонних метаболизму веществ.

 

Третья статья говорит об окислении в нитриты. Питательным веществом в этом случае служит NH3, значит, аммиачные соли должны диссоциировать. Оптимум дыхания соответствует N/200 NH4, т. е. 90 мг на 1 л, или 660 мг (NH4)2S04; при количестве этой соли, соответствующем 0,1 %, дыхание будет уже менее интенсивным.

При давлении до г/2 атмосферы дыхание не понижается, при х/з-атмосферы оно понижается только на 8%, при — на 32%, при Vio — на 65%, при V2o — па 84%.

Оптимальная зона рН очень ограничена, а именно, от 8,4 до 8,8. При 9,4—9,5 дыхание прекращается.

 

Повторяем еще раз, что эти данные относятся только к расе бактерий, служившей для опытов.

Что касается задерживающего влияния органических соединений, то глюкоза и в этом случае слабее действует на дыхание, чем на развитие культуры. Совершенно иначе обстоит дело с амино-и амидосоединениями. Мочевина в количестве 0,025 моля понижает дыхание на 27 %, в количестве 0,05 па—58%, а в количестве 0,10— на 77%; аспарагин в количестве 0,005 моля снижает дыхание на 34%, 0,01 —на 70%, а 0,02 — на 80%.

Мы подробно остановились на этих имеющих важное значение исследованиях, так как они, подтвердив прежние, полученные лет за двадцать перед тем физиологические данные, в некотором роде модернизировали их, ввели новые понятия, еще не существовавшие во время наших первых работ.

Около 1919 г. к разработке вопроса приступают в Америке. Джиббс [8], полагая, что опыты Виноградского никогда не производились в Америке, берется за повторение всей программы. Он делает заключение, что очень длительной культуры обогащения (до 50 поколений) недостаточно для удаления посторонних зародышей; выделение обеих бактерий ему удается при помощи способов, указанных в нашей старой работе. Он пользуется мясным бульоном для контроля чистоты культуры.

Аугусто Бонацци [9] в четырех статьях (1919—1923) говорит о Nitrosococcns, который он считает тождественным с выделенным Виноградским из почв Америки. Он производит с этой бактерией опыты, приводящие к интенсивному образованию нитритов в растворе; изучает действие углекислоты на ее развитие; рассматривает, наконец, роль солей железд при окислении.

 

Фред и Давенпорт [10] изучают специально действие органических соединений на Nitrobacter, выделенный на агаре с нитритами. Бактерии не развиваются в моче, в мясном бульоне, в растворе питательного вещества Гейдена; быть может, добавляют авторы, слабое развитие происходит па агаре с прибавлением последнего из названных веществ. Они настаивают на том, что выделенные ими бактерии, которые они сохраняют до шести недель в мясном бульоне (где они остаются в состоянии покоя), пе теряют способности к окислению до нитратов, вопреки утверждению Бейериыка; после пересева в минеральный раствор эта способность сразу восстанавливается.

После стольких проверок и повторений вопрос все еще не представляется, повидимому, устаревшим: через несколько лет, в 1929 г., появляются

четыре исследования, и три из них относятся к категории работ, следующих по пути прежних.

Гепбюльт [11], вновь обращаясь к жидким элективным культурам, жалуется на трудности, связанные с освобождением специфических зародышей от примесей; ему не удается, даже после нескольких пересевов на пластинках кремнекислого геля, получить культуры, выдерживающие проверку высевом на бульон. Он принужден в конце концов прибегнуть к методу разведений, при помощи которого он только через шесть месяцев достигает того, что нитрификацию вызывает одна определенная бактерия, не развивающаяся в органических питательных средах и обладающая морфологическими признакамин Nitrosomonas. Он вновь исследует действие органических соединений на эту бактерию: она менее чувствительна к глюкозе, но более чувствительна к пептону.

ХорстЭнгель [12] ставит с выделенной Гейбюльтом бактерией опыты по ассимиляции углекислоты. Он подтверждает хемосинтез, пользуясь аппаратом собственной конструкции для микроанализа.

Рубенчик [13] исследует нитрифицирующих бактерий в особых естественных средах: соленых озерах — лиманах—около Одессы. Он находит там галофильную нитритную бактерию, которую оп не без затруднения выделяет в чистую культуру. Он испытывает ее отношешге к органическим соединениям—глюкозе, пептону и т. п. и находит его весьма сходным с отношением, установленным старыми исследованиями (Виноградский и Омелянский).

 

Наконец, Нельсон [14] публикует в 1931 г. подробную статью, в которой он вновь разрабатывает те же вопросы по прежней программе. В первой статье (см. ниже) автор сообщает, что ему не удалось выделить возбудителей нитрификации, пользуясь раствором с прибавлением органического питательного вещества (сахара). Затем он преодолевает это препятствие, прибегнув к микроманипулятору. Ему удается выделить обе нитрифицирующие бактерии, которые характеризуются теми же, столько раз описанными признаками. Он наблюдает у выделенных им рас большую выносливость к декстрозе, пептону, глицерину; но в то же время констатирует, что декстроза не потребляется, так как внесенное количество ее нисколько не уменьшается. Он расширяет свои опыты, прибавляя к культурам в минеральном растворе различные растительные вещества — солому пшеницы, ржи, ячменя, овса, люцерны, а также навоз — все это в высушенном и превращенном в порошок виде. Во всех этих случаях развитие нитрификаторов совершенно прекращается, погибает даже Nitrosomonas, так как повторные пересевы не вызывают возобновления процесса.

Перейдем теперь к исследованиям, не согласным с прежними результатами; авторы их отстаивают существование гетеротрофных нитрифицирующих бактерии, развитию которых органические питательные вещества не только не мешают, но, наоборот, содействуют.

 

Первыми по времени являются в этой группе исследования Штутцера [15] и его сотрудников Бурри и Гартлеба над некиим Hyphomicrobium пли Salpeterpilz, крайне плеоморфным, способным к нитрификации и к различным другим функциям. Но критиковать их бесполезно, так как Штутцер скоро честно отказался от своих утверждений, согласившись с данными Виноградского. Другие так не поступали, хотя причина несогласия была все та же: чрезвычайная трудность выделения нитрификаторов в среде, содержащей органические питательные вещества. В такой среде образуется смешанная микрофлора, которая вызывает муть в питательном бульоне, нитрифицирует в солевом растворе, и при достаточной длительности опыта может, наконец, нитрифицировать даже мясной бульон. Давнишний опыт Омелянского, такой простой и ясный, очень хорошо иллюстрирует разнообразные активности такой смешанной микрофлоры: комбинируя различным образом В. ramosus, Nitrosomonas и Nitrobacter при их посеве в пептонном бульоне, он получал четыре комбинации:

В. ramosus + Nitrosomonas + Nitrobacter — образование нитратов;

В. ramosus 4- Nirtoscmonas — образование нитритов;

В. ramosus + Nitrobacter — только один аммиак;

Nitrosomonas -f Nitrobacter — никакой мути, никакой активности.

 

Итак, если исследователь не будет достаточно осторожен, если он слишком рано признает свою культуру чистой, то он получит в ней эти положительные реакции и найдет в них подтверждение своего йредставле- ния о гетеротрофном виде с разнообразными функциями, который способен окислять органический и минеральный азот в нитриты и нитраты, развиваясь в бульоне и минеральных растворах.

 

Крайне грубая техника Фремлина [16], а также Зака [17], которую тем не менее цитируют, говоря о нитрификации, не оставляет никакого сомнения относительно присутствия в их опытах гетеротрофных видов и даже целого ассортимента их .

 

Ошибок такого рода, по правде сказать, избежать трудно, если от них не предохрапяет идея о специальной энергетике исследуемых бактерий. Их не избежал даже такой первостепенный ученый, как Бейеринк [18]; он утверждал, что бактерия окисления в нитраты, названная им Nitrobacter oligotrophum, бывает «наследственно стойкой» только в отсутствие растворимых органических веществ; при более обильном питании, вмясо-пеп- тонном бульоне, например, она немедленно превращается в Nitrobacter poly- trophum, теряя навсегда способность образования нитратов; даже самых малых количеств органических питательных соединений, не превосходящих 0,05% глюкозы, пептона, аспарагина, уксуснокислого натрия и т. п. достаточно, для того чтобы вызвать такое превращение. С его точки зрения рост и нитрификация являются якобы несовместимыми, причем последняя может начаться только после полного прекращения роста, обусловленного исчезновением малейших следов органического питательного вещества. Ибо олиготрофное состояние неспособно к хемосинтезу; такая способность приписывается ему неправильно.

Критика этой теории, экстравагантной с той точки зрения, что она рассматривает нитрификацию — явление большой продуктивности — как явление в некотором роде истощения, т. е. патологическое, была сделана в другом месте [19]; здесь мы упоминаем об этой работе только как q6 особенно наглядном примере ошибки, ставшей за последние сорок лет хронической. Думается, что знаменитый бактериолог мог бы избегнуть ее, если бы он более считался со старыми исследованиями (Виноградский).

Другой источник ошибок надо искать в применении реактива Петер— Грисса, отличающегося высокой чувствительностью. Он обнаруживает азотистую кислоту при концентрации в 0,001 мг на литр. А ведь азотистая кислота очень распространена в воздухе лабораторий. Об этом источнике ошибок много говорилось в прежних работах .

Такой источник ошибок кроется и в самой среде, которая может содержать не поддающиеся выявлению следы нитратов (так как столь же чувствительная реакция для нитратов неизвестна); нитриты, обнаруженные крайне чувствительной реакцией, могут образоваться в результате восстановления этих следов нитратов.

К несчастью, с указанными источниками ошибок недостаточно считались, и было слишком много исследователей, рассматривавших как явления нитрификации все случаи, в которых получалась положительная реакция Петер—Грисса, несмотря на то, что она свидетельствовала лишь о бесконечно малых и изменчивых следах нитритов, а в культурах отчетливо преобладали явления восстановления.

Рунов [20 и 21], Мишустин [22], Губин [23] не смешивают, правда, эфемерное образование нитритов с настоящим процессом нитрификации, но все же видят в нем новый источник нитритов в природе. Заметим, что эта мысль не так нова, как им кажется. Еще Гереус [24] в 1886 г. приписывал способность к нитрификации почти всем видам, служившим ему для опытов, а именно, Micrococcus prodigiosus, спириллам, сыра, бациллам сибирской язвы, Staphylococcus pyogenes и многим другим.

Нитрифицирующие организмы, выделенные Нельсоном [25] в его первой работе (1929), относятся к той же группе. Разбирать указанную работу бесполезно, так как в своей второй, упомянутой выше работе, автор сам сумел исправить ошибки первой.

Исследование Кутлера и Мукерджи [26] требует некоторых замечаний, так как авторы считают, что они доказали, будто бы многочисленные виды, выделенные ими на маннитном агаре Торнтона, вызывают нитрификацию в почве. А между тем опыт со стерилизованной почвой, с прибавлением довольно большого количества сернокислого аммония при засеве предполагаемыми тарификаторами, дал максимально 2 мг азотистой кислоты на 1 кг почвы, да и то только один раз; в остальных случаях получались гороздо меньшие количества азотистой кислоты, следы или полное отсутствие ее. Гораздо вероятнее поэтому приписать появление следов нитритов процессу восстановления нитратов, несомненно имевшихся в регулярно унаваживаемой почве Барнфильда (в Ротамстеде), а не окислению аммиака, который, находясь в почве в количестве нескольких сотен миллиграммов на 1 кг, не подвергался, очевидно, сколько-нибудь заметному окислению. В этом отношении результат опыта является определенно отрицательным, и можно только удивляться, как сами авторы не заметили этого. Более чем вероятно также, что бесконечно малые следы нитритов в опытах произведенных в растворе сахара, должны быть приписаны той же причине, т. е. восстановлению следов нитратов, содержавшихся в жидкостях. Контрольная почва и стерилизованные и не засеянные колбы положительной реакции не дали, так как в них процессы восстановления ые имели, разумеется, места.

Все указанные до сих пор работы рассматривали вопрос с точки зрения микробиологии и общей физиологии; те, к которым мы перейдем теперь, занимались прежде всего применением полученных данных к явлениям нитрификации в с а м о ii почве. Новые данные затрагивали классические понятия агрохимии, согласно которым нитраты являются единственным нормальным продуктом нитрификации, присутствие же нитритов является только показателем неправильного хода окисления. Отрицательное отношение тарификаторов к органическим питательным веществам, а нитратных бактерий специально к аммиаку, рассматривалось, по понятным причинам, как трудно согласуемое с функциями этих микробов и условиями, в которых протекает их жизнедеятельность.

Выразителем этих мнений является Лёнис [27] в его критике, «направленной против двух положений Виноградского». Он утверждает/что две фазы нитрификации идут последовательно одна за другой только в связи с составом среды, которой пользовался Виноградский. Понизив количество аммиачной соли и заменив углекислый магний углекислым кальцием, легко можно, с его точки зрения, получить непосредственное окисление аммиака в нитраты. Задерживающего действия аммиака при такой постановке опыта не замечается.

Наряду с тем, что аммиак, по его мнению, не играет при нитрификации специфической роли, органические соединения также не оказывают никакого влияния на происхоящие в почве явления; нужно только, чтобы процент этих соединений, а равно и аммиака, не был слишком велик, чего в почве никогда и не бывает. Словом, отрицательное отношение, которое считается прр1сущим нитрифицирующим бактериям, ощущается только в ненормальных условиях среды Виноградского и Омелянского, в природе же с ними не приходится считаться. Там ход процессов регулируется скорее аэрацией: нитрификация, которая протекает при свободном доступе воздуха, сменяется денитрификацией, когда аэрация становится недостаточной.

Уже и в то время были известны причины, объясняющие возможность прямого окисления до нитратов в почве; главная из них заключается в том, что среда уже населена специфическими бактериями, а ионы NH3 действуют подавляюще, преимущественно на размножение нитратных бактерий, а не на процесс окисления, вызываемый взрослыми клетками. Кроме того, играет роль количество: при понижении процента аммиака окисление в нитраты усиливается, при повышении оно замедляется; значит, процесс управляется одними и теми же факторами, как в сосуде так и в почве. Затем, Лёнис забывает, что вопрос не ограничивается пахотной землей — средой, всегда содержащей много тарификаторов и относительно бедной органическими соединениями и аммиаком,-—- что существует много иных сред, очень богатых и органическими соединениями и аммиаком: отбросы и нечистоты, свалки, биологические фильтры и т. п. Впрочем, даже и в почве явление протекает не всегда по прежней схеме агрохимиков; например, в лесных почвах или в обработанных болотах, в которых еще нет возбудителей нитрификации, процесс склонен происходить в две фазы, так же как и в культурах на искусственных средах. Более того, довольно часто встречаются почвы старинной культуры, в которых нитритная фаза ясно отграничена от нитратной; последняя всегда запаздывает, что зависит, очевидно, от сравнительной плотности и активности двух групп бактерий.

Наконец, что касается аэрации, как фактора, решающего смену одного процесса другим, — нитрификации, с одной стороны, денитрификации, с другой, — то это утверждение не опирается ни на какое экспериментальное доказательство. Оно совершенно невероятно: мы не видим, как может фактор аэрации разграничить но времени два антагонистических процесса; ведь денитрификация не требует полного анаэробиоза, а нитрификация может происходить и при очень незначительной аэрации. Значит, если бы не было других, играющих активную роль факторов, оба процесса могли бы идти одновременно, неизбежным результатом чего была бы полная потеря образующихся нитратов. Не может быть и речи, чтобы в ходе медленного явления, подобного нитрификации, образовалось такое количество продуктов, которое могло бы превзойти или даже покрыть потери, причиняемые бурным процессом вроде денитрификации. Самый тот факт, что нитрификация азотистых соединений неизменно приводит к накоплению в среде нитратов, указывает на существование более надежного фактора для разъединения двух антагонистических процессов. Этот фактор был ясно определен в заключении статьи Виноградского и Омелянского (1899), см. № VII, стр. 205: отсутствие выносливости обоих специфических микробов к органическим соединениям замедляет их жизнедеятельность вплоть до распада означенных веществ. В результате распада среда становится непригодной для развития денитрификаторов; к общему для обоих нитрификаторов свойству — отрицательному отношению к органическим веществам — присоединяется чувствительность нитратных бактерий к ионам NH3, что еще более задерживает их появление, оттесняя его на последнее ]\*»е сто в ряду процессов, из которых слагается минерализация.

Возражения Лёниса дали нам случай напомнить только что цитированное заключение, которое в свое время не привлекло должного внимания, может быть, именно вследствие этих возражений. Между тем, оно говорит об одном из самых важных двигателей, регулирующих последовательный ход микробиологических процессов в природе.

Критика ^Лёниса вызвала целый ряд экспериментальных работ, направленных против опровергаемого им положения относительно воздействия органических соединений.

Лесли Кольмаи [28] долго работает главным образом с нестерилизо- ванной почвой с прибавлением все возрастающих количеств сахара и наблюдает, как ему кажется, что сахар ускоряет нитрификацию. Опыты с культурами сомнительной чистоты не дают ему сколько-нибудь постоянных результатов; пептон, аспарагин, мочевина оказывают определенно задерживающее действие; попытки замены' углекислоты как источника углерода глюкозой не удаются, нитрифицирующие бактерии не развиваются без углекислоты. Однако, несмотря на все эти отрицательные факты, автор отстаивает мнение о стимулирующем действии г л ю- коз ы, природу которого, как сам же признает, он не может объяснить.

Стивене и Витерс [29], экспериментируют со стерилизованной почвой с прибавлением пептона, навоза и т. п. и параллельно — с раствором, в который внесены те же вещества, засевая обе среды взвесью почвы. Они приходят к заключению, что органические соединения не всегда влияют на нитрификацию неблагоприятно и что непосредственное применение выводов Виноградского к почве полей должно быть оставлено.

О наблюдениях такого же рода говорится в статье Карпинского и Никлевского [30]. Никлевский [31] приходит к тем же заключениям, не стараясь точно разграничить роль различных возбудителей, активности которых налагаются друг на друга. Все это приводит мало-помалу к недоразумению, вследствие которого Виноградскому и Омелянскому приписывают утверждение, совершенно противоречащее действительности, будто бы органические соединения всегда ослабляют естественный процесс нитрификации.

Такой взгляд считают неприемлемым. В особенности осуждает его Крузе [32] в «Руководстве по общей микробиологии». Он приходит к заключению, что теория, опровергаемая Лёнисом и другими, отжила свой век.

Это показывает, что подробную статью по данному вопросу плохо поняли или даже плохо прочитали (Виноградский и Омелянский, 1899; см. № VII, стр. 205). Дело идет не о естественном явлении, но о деятельности микробных возбудителей, выделенных в состоянии безупречной чистоты. Отрицательная реакция вовсе не являлась абсолютной, она определялась качеством и количеством вносимых веществ. Небольшая таблица, представляющая дозы органических веществ и полученный эффект, столько раз воспроизводилась в различных статьях и книгах, что здесь нечего возвращаться к приведенным в ней результатам. Напомним только, что нами было сделано различие между количествами только задерживающими, крайне слабыми, и количествами парализующими; бактерицидного действия испробованные дозы органических веществ не проявляли. Мы установили тот факт (подтвержденный впоследствии Буланже и Массолем, а затем Мейергофом), что эти вещества задерживают главным образом развитие, но что они действуют гораздо слабее на процесс окисления. В уже развившихся культурах их угнетающее действие сказывается гораздо меньше. (Опыт № 10, стр. 211). Было отмечено, что путем пересевов Nitrobacter можно приучить к постепенно возрастающим количествам органических соединений (ст. VII, опыты № 24, 27, 32). Наблюдалась, наконец, своего рода активация процесса окисления под влиянием малых количеств органических соединений (там же, опыты № 2, И, 18, 19), в особенности глюкозы и вытяжек из растительных веществ: в культурах, содержащих их, процесс заканчивался на день или на два раньше, чем в контрольных. Но мы не спешили истолковывать этот факт, как стимулирующее воздействие, свойственное данным веществам. Нас предохранило то обстоятельство, что легкого изменения состава основного раствора (путем прибавления некоторого количества железа) достаточно для полного устранения благоприятного действия, вызванного внесением в питательную среду органических соединений.

В настоящее время, когда установлено понятие о рН, которого тогда не было, приходится только радоваться такой осторожности. Совершенно очевидно, что органические соединения могут изменять в том или другом направлении концентрацию водородных ионов. Особенное значение имеет сахар (опыты Кольмана); его разложение вызывает в загрязненной культуре образование кислот, превращающихся затем в карбонаты. Растительные вытяжки, всегда слегка кислые, также могут менять в благоприятную сторону рН опытного раствора, если последний имеет слишком большую щелочность.

В общем, хотя стимулирующее воздействие в той или иной форме, например, в форме катализа, и не представляется невероятным, мы все же не находим в литературе ни одного опыта, результаты которого являлись бы в этом смысле дЬказательными.

Кончая наш обзор, подведем итог коллективной работы за 40 лет. Прежде всего отметим, что работа эта подтвердила все результаты старых исследований. Некоторые различия в подробностях легко объясняются тем, что разные наблюдатели в разных странах рабо тали не с одними и теми же расами.

Бесспорно установлено, что активные возбудители принадлежат исключительно к физиологической группе, энергетика которой основана на окислении неорганических веществ,— к группе автотрофов.

Все усилия найти гетеротрофов, способных выполнять такую функцию, были напрасны или же привели к ошибкам.

Подтвердилось, что специфические возбудители разделяются по своим функциям на две группы: возбудителей нитритного и возбудителей нитратного окислений. Никогда не было найдено ни одного организма, способного производить окисление иона NH3 прямо в азотную кислоту.

Лишь один ученый [33] говорил 25 лет назад о существовании бациллы, ведущей непосредственное окисление аммиачного азота в нитраты,—Bacillus nitrator; он даже предсказывал существование еще другого возбудителя, способного окислять прямо в нитраты газообразный азот. Это были только смелые гипотезы, впоследствии не подтвердившиеся .

Было, кроме того, установлено, что физиологические свойства, присущие нитрифицирующим бактериям, оказывают решающее влияние на ход всего комплекса явлений, связанных с нитрификацией органического азота, разделяя во времени процессы распада органических молекул и процессы окисления образовавшегося аммиака.

Наконец, последний вывод, который можно сделать из вышеизложенного обзора. Обзор этот мог быть гораздо короче, если бы дело шло только о том, чтобы напомнить достигнутые результаты, но мы поставили себе целью показать, кроме того, что познание столь важных бактерий подвинулось вперед очень мало и, в особенности, что не было найдено никакого нового метода для облегчения и расширения их изучения. Все авторы строго придерживались прежнего плана, а именно: 1) элективной культуры или культуры обогащения в растворе со внесением аммиака или солей азотистой кислоты; 2) выделения бактерий при помощи указанного метода в чистую культуру; 3) хемосинтеза; 4) влияния на обоих возбудителей органических питательных веществ и аммиака.

Однако с давних пор представлялось несомненным, что было бы крайне желательно заменить долгий и трудный метод, которым пришлось пользоваться для выделения наших возбудителей первый раз, другим, более скорым. В противном случае разработка проблемы будет неизбежно продвигаться чересчур медленно. Ведь именно вопросы, касающиеся роли нитрифицирующих бактерий в природе, и задерживали главным образом дальнейшее движение вперед.

Но прежде чем перейти к основательному разбору старого метода и к описанию нового, нам остается рассмотреть два вопроса: 1) вопрос о рН, занимались прежде всего применением полученных данных к явлениям нитрификации в с а м о и п о ч в е. Новые данные затрагивали классические понятия агрохимии, согласно которым нитраты являются единственным нормальным продуктом нитрификации, присутствие же нитритов является только показателем неправильного хода окисления. Отрицательное отношение нитрификаторов к органическим питательным веществам, а нитратных бактерий специально к аммиаку, рассматривалось, по понятным причинам, как трудно согласуемое с функциями этих микробов и условиями, в которых протекает их жизнедеятельность.

Выразителем этих мнений является Лёнис [27] в его критике, «направленной против двух положений Виноградского». Он утверждает, что две фазы нитрификации идут последовательно одна за другой только в связи с составом среды, которой пользовался Виноградский. Понизив количество аммиачной соли и заменив углекислый магний углекислым кальцием, легко можно, с его точки зрения, получить непосредственное окисление аммиака в нитраты. Задерживающего действия аммиака при такой постановке опыта не замечается.

Наряду с тем, что аммиак, по его мнению, не играет при нитрификации специфической роли, органические соединения также не оказывают никакого влияния на происхоящие в почве явления; нужно только, чтобы процент этих соединений, а равно и аммиака, не был слишком велик, чего в почве никогда и не бывает. Словом, отрицательное отношение, которое считается присущим нитрифицирующим бактериям, ощущается только в ненормальных условиях среды Виноградского и Омелянского, в природе же с ними не приходится считаться. Там ход процессов регулируется скорее аэрацией: нитрификация, которая протекает при свободном доступе воздуха, сменяется денитрификацией, когда аэрация становится недостаточной.

Уже и в то время были известны причины, объясняющие возможность прямого окисления до нитратов в почве; главная из них заключается в том, что среда уже населена специфическими бактериями, а ионы NH3 действуют подавляюще, преимущественно на размножение нитратных бактерий, а не на процесс окисления, вызываемый взрослыми клетками. Кроме того, играет роль количество: при понижении процента аммиака окисление в нитраты усиливается, при повышении оно замедляется; значит, процесс управляется одними и теми же факторами, как в сосуде так и в почве. Затем, Лёнис забывает, что вопрос не ограничивается пахотной землей — средой, всегда содержащей много нитрификаторов и относительно бедной органическими соединениями и аммиаком,— что существует много иных сред, очень богатых и органическими соединениями и аммиаком: отбросы и нечистоты, свалки, биологические фильтры и т. п. Впрочем, даже и в почве явление протекает не всегда по прежней схеме агрохимиков; например, в лесных почвах или в обработанных болотах, в которых еще нет возбудителей нитрификации, процесс склонен происходить в две фазы, так же как и в культурах на искусственных средах. Более того, довольно часто встречаются почвы старинной культуры, в которых нитритная фаза ясно отграничена от нитратной; последняя всегда запаздывает, что зависит, очевидно, от сравнительной плотности и активности двух групп бактерий.

Наконец, что касается аэрации, как фактора, решающего смену одного процесса другим, — нитрификации, с одной стороны, деиитрификации, с другой, — то это утверждение не опирается ни на какое экспериментальное доказательство. Оно совершенно невероятно: мы не видим, как может фактор аэрации разграничить ко времени два антагонистических процесса; ведь денитрификации не требует полного анаэробиоза, а нитрификация может происходить и при очень незначительной аэрации. Значит, если бы не было других, играющих активную роль факторов, оба процесса могли бы идти одновременно, неизбежным результатом чего была бы полная потеря образующихся нитратов. Не может быть и речи, чтобы в ходе медленного явления, подобного нитрификации, образовалось такое количество продуктов, которое могло бы превзойти или даже покрыть потери, причиняемые бурным процессом вроде денитрификации. Самый тот факт, что нитрификация азотистых соединений неизменно приводит к накоплению в среде нитратов, указывает на существование более надежного фактора для разъединения двух антагонистических процессов. Этот фактор был ясно определен в заключении статьи Виноградского и Омелянского (1899), см. № VII, стр. 205: отсутствие выносливости обоих специфических микробов к органическим соединениям замедляет их жизнедеятельность вплоть до распада означенных веществ. В результате распада среда становится непригодной для развития денитрификаторов; к общему для обоих нитрификаторов свойству — отрицательному отношению к органическим веществам — присоединяется чувствительность нитратных бактерий к ионам NH3, что еще более задерживает их появление, оттесняя его на последнее место в ряду процессов, из которых слагается ми рализация.

Возражения Лёниса дали нам случай напомнить только что цитированное заключение, которое в свое время не привлекло должного внимания, может быть, именно вследствие этих возражений. Между тем, оно говорит об одном из самых важных д в и г а т е л е й, р е г у л и р у- ющих последовательный ход микробиологических процессов в природе.

Критика Лёниса вызвала целый ряд экспериментальных работ, направленных против опровергаемого им положения относительно воздействия органический соединений.

Лесли Кольман [28] долго работает главным образом с нестерилизо- ванной почвой с прибавлением все возрастающих количеств сахара и наблюдает, как ему кажется, что сахар ускоряет нитрификацию. Опыты с культурами сомнительной чистоты не дают ему сколько-нибудь постоянных результатов; пептон, аспарагин, мочевина оказывают определенно задерживающее действие; попытки замены углекислоты как источника углерода глюкозой не удаются, нитрифицирующие бактерии не развиваются без углекислоты. Однако, несмотря на все эти отрицательные факты, автор отстаивает мнение о стимулирующем действии г л ю- козы, природу которого, как сам же признает, он не может объяснить.

Стивене и Витерс [29], экспериментируют со стерилизованной почвой с прибавлением пептона, навоза и т. п. и параллельно — с раствором, в который внесены те же вещества, засевая обе среды взвесью почвы. Они приходят к заключению, что органические соединения не всегда влияют на нитрификацию неблагоприятно и что непосредственное применение выводов Виноградского к почве полей должно быть оставлено.

О наблюдениях такого же рода говорится в статье Карпинского и Никлевского [30]. Никлевский [31] приходит к тем же заключениям, не который наши бактерии ищут в природе; 2) обычные методы, применяемые для изучения нитрифицирующей способности почв. Оба вопроса возникли сравнительно недавно.

Вопрос о рН. Понятие о рН, лишь только оно было установлено, сразу же утвердилось в области нитрификации, как и во всех вообще областях микробиологии. Прежние наблюдения показали, что для развития процесса нитрификации необходимы щелочная реакция и присутствие карбонатных оснований. Мойергоф констатировал в своих опытах над дыханием возбудителей нитрификации, что обе бактерии требуют высокого рН, а именно от 8,4 до 8,8 для окисления в нитриты и от 8,4 до 9,3 для окисления в нитраты. Но такое заключение скоро встало в противоречие с исследованиями процессов, происходящих в различных почвах. Риттер [34], Арнд [38], Вейсс [37], Бартель [36], Галль, Миллер и Гиммингам [35], изучая почвы Швеции, Дании, Германии, Англии, установили, что нитрификация может иметь место в отчетливо кислых почвах. Эти наблюдения удивили, как несовместимые с классическими данными относительно обязательных условий возникновения нитрификации. «Мы ничего не знаем пока о причинах, вызывающих нитрификацию в кислой почве,— замечает Бартель после опыта такого рода,— идет ли тут дело об уже известных формах, специально приспособившихся к кислой среде, или об еще неизвестных возбудителях».

Таким образом, вопрос о рН был сразу же связан с вопросом размножения рас, приспособляющихся к различным внешним условиям.

Вопрос о значении рН разрабатывается всего полнее в обширных исследованиях Гаардера и Хагема [39]; для того чтобы ознакомиться с современным положением в этой области, достаточно будет разобрать их работы.

Многочисленные опыты названных норвежских ученых, произведенные над 142 пробами почв, взятых из ста местностей, проводились все по одной и той же схеме: серия А в 10—12 колб, содержащих «несколько измененный раствор Виноградского», засевается одновременно пробой почвы по 5 г на колбу. При помощи буферной смеси одноосновной и двуосновной фосфорнокислых солей в отдельных пробах этого раствора устанавливаются различные рН так, чтобы получилась лестница в 10—20 ступеней, начиная с 4,5—5,0 и кончая 8,0—9,0. Дней через тридцать ставится опыт со второй серией. В того же состава, каждая колба которой засевается из соответственной колбы серии А с тем же рН. Следует серия С, иногда еще и серия D, совершенно по тому же принципу. Дней через тридцать производится определение образовавшихся нитратов. Оказывается, что наиболее интенсивная нитрификация происходит в различных пробах почвы при различных рН. Эта разница стабилизируется по мере пересевов. Из опытной колбы с оптимальным для определенной пробы почвы рН производится засев новой полной серии с 10—12 различными ступенями концентрации водородных ионов. Из них снова выбираются проявлявшие наибольшую активность культуры, и операция повторяется; это приводит в конце концов к ряду отдельных линий, действующих только в тесных пределах рН и становящихся мало активными, а то и вовсе неактивными за этими пределами.

Один и тот же способ применялся как для нитритных, так и для нитратных бактерий.

Из всех этих многочисленных опытов авторы выводят заключение, что должно существовать несколько рас или видов нитрифицирующих бактерий, характеризующихся активностью лишь при определенном, строго ограниченном рН. Они считают себя в праве утверждать, что для окисления до пит- ритов в природе имеются по крайней мере три расы, которые они обозначают как a, 7, но они склонны, хотя с меньшей уверенностью, допустить еще и три других. То же самое и для окисления до нитратов: расы а, 0, с, d и сверх того еще три, менее ясно различающиеся но оптимальному для них рН. Вот таблица оптимальных рН, присущих каждой расе:

Нитритные бактерии           Нитратные бактерии

а          7,7—7,9          а          6,3-6,4

Р          6,7-6,8 Ъ         6,8

Y         .           6,5       с          7,0—7,3

?          7,0—7,2          (1                                8,2—8,4

?          9,0       ?          7,6—7,9

?           6,0 ?.,......... 9,0

?          9,2—9,4

В общем, значит, существует около шести рас нитритных и около семи нитратных бактерий, которые отличаются постоянным признаком оптимального для них рН.

Мы увидим в дальнейшем, что заключение названных авторов, являющееся в общем лишь гипотезой, приближается в некоторых отношениях к действительности. Однако описанный способ нельзя признать сколько- нибудь доказательным. Он находит оправдание и объяснение только в том, что авторы не располагали более совершенным методом для выделения видов и рас нитрифицирующих бактерий и для характеристики их lege artis.

Ниже мы еще цродолжим обсуждение этого вопроса.

 

 

 

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ

 

 

Последние добавления:

 

Ферсман. Химия Земли и Космоса

 

Перельман. Биокосные системы Земли

 

БИОЛОГИЯ ПОЧВ

 

Вильямс. Травопольная система земледелия

 

История русского почвоведения

 

Качинский - Жизнь и свойства почвы

 

Вернадский - ЖИВОЕ ВЕЩЕСТВО