МЕТОДЫ ПОЧВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

Выращивание микрокультур в чашке Петри

Его техника очень проста: надо взять плотную среду, пропитанную энергетическим веществом, и засеять ее комочками почвы (см. статью VI).

Такой средой может служить, очевидно, только минеральный гель, а именно, кремнекислый: его нельзя заменить агаром, так как последний представляет собой не просто безразличную среду, но сам по себе является питательным веществом.

О нашем, элементарно простом способе приготовления геля не стоило оы Е говорить, если бы не были предложены другие способы, менее практичные и достоверные. Этим и объясняется, вероятно, то, что гель медленно внедряется в практику. Его недостатками считают то, что приготовление его требует слишком много труда, чт< при просушивании он теряет эластичность, что он не выдерживает стерилизации по£ Давлением. Из всего этого справедливо только последнее, но в большинстве агробиологических опытов, особенно в тех, о которых говорится в настоящей статье, продол жительная стерилизация при температуре выше 100' совершенно бесполезна Повтори* же еще раз приемы, уже годами практикующиеся в нашей лаборатории.

Мы смешиваем в равных долях раствор чистого, бесцветного кремнекислого натрия, разбавленного до Боме^ебляной кислотой, разведенной до 13' Боме, наливая силикат в кислоту. Смесь распределяем по чашкам Петри по 30 мл в чашку диаметром 10 см, н по 200 мл в чашку диаметром 20 см. Выжидаем сутки, пока гель не станет хорошо вибрирующим, в чем убеждаемся, взяв чашку в руку и слегка ударяя но ней. Промываем чашки проточной водой в большой кювете (60 на 80 см), в которой может поместиться несколько дюжин маленьких чашек и дюжина больших. Оставляем их в токе воды по крайней мере на два-три дня, после чего промываем их кипящей дистиллированной водой. Последняя промывная вода не должна давать мути с азотнокислым серебром. Затем маленькие чашки ставим крышками вниз в стеклянные сосуды (диаметром 25 см и глубиною 6 см), куда входит целая дюжина их; большие же перевертываем, налив в крышку немного воды. Те и другие сохраняются в хорошем виде в течение многих месяцев, так что мы всегда имеем их под рукой, готовыми для опытов. Приступая к работе с ними, погружаем их ненадолго в кипящую воду: для этого пользуемся изображенным на 45 небольшим ситом (продающимся как хозяйственная утварь), на которое помещаем чашку диаметром 10 см. Чашку ставим в воду при полном кипении и держим ее там около 30 секунд. Пузырьки, появляющиеся при этом в геле, впоследствии исчезнут.

Готовый гель пропитывается питательными минеральными солями и соответственным энергетическим веществом. Выбор, разумеется, огромен, но биолог останавливается, естественно, на тех соединениях, которые имеют наибольшее биологическое значение; на спиртах, органических кислотах, сахарах, полисахаридах, аминосоединениях, протеидах. Внесенное вещество должно быть всегда единственным оргапическим соединением в среде. Это — главное условие: опыт будет сведен на нет, если внести комплекс питательных веществ, как это принято в общей микробиологии, т. е. углеродистое соединение вместе с пептоном, аспарагином или каким-нибудь другим азотистым органическим соединением. Быстрое и сильное развитие микробов, вызываемое такими азотистыми веществами, совершенно замаскировало бы результат действия испытываемых углеродистых веществ.

В случае же безазотистого вещества источником азота в среде может быть только минеральное соединение — аммиачная соль или нитраты, которые обыкновенно и встречаются в почве.

Если дело идет о фиксаторах азота, для каждого из испытываемых веществ надо произвести параллельпый опыт с полным отсутствием связанного азота.

Если мы хотим вызвать развитие нитрификаторов, следует органическое соединение заменить аммиачной или азотистой солью.

Засев чашек производится маленькими комочками почвы и потому изготовление средней пробы должно быть очень тщательным. Следует избегать слишком большого высушивания пробы, чтобы сохранить нормальную структуру почвы. Соответственную степень влажности легко определить просто наощупь, дезинфицировав, в случае надобности, пальцы. Прежде чем пропустить почву через алюминиевое, предварительно фламбирован- ное сито с отверстиями в 1 мм, надо растереть крупинки пальцами. Таким образом приготовляют образцы приблизительно по 500 г и сохраняют их в продолжение опытов в закупоренных флаконах, определив предварительно их влажность.

Нельзя брать случайные количества почвы; навеска должна быть взвешена с точностью до второго десятичного знака с расчетом на сухой вес. Она должна быть невелика для того, чтобы вместе с нею не было внесено заметных количеств какого-нибудь дополнительного питательного вещества. Для чашки Петри в 10 см, которой мы обыкновенно пользуемся, достаточно 0,1 г, максимум 0,2 г.

Если дело идет об очень активной почве, навеску которой мы хотим определить с большой точностью, это легко сделать при помоши маленького тигля Гуча с блюдечком и крышкой; мы кладем в пего немного почвы, взвешиваем с точностью до третьего десятичного знака, потом берем тигель и, слегка встряхивая его, бросаем на поверхность чашки столько комочков земли, сколько нужно для засева. При вторичном взвешивании потеря в весе будет соответствовать весу засеянной почвы.

Предположим теперь, что чашки готовы, засеяны почвой, поставлены в термостат при 30°. За какими явлениями надо следить? Они могут быть с точностью определены следующим образом:

Надо уловить начало роста тех микробов, которые развиваются раньше всех других; они в то же время являются и господствующими.

Развитие господствующих микробов занимает при нашем методе место традиционной чистой культуры: совершенно ясно, что такое преобладание является выражением специальной приспособленности определенных микробов к воздействию на данное вещество и к устранению всех конкурентов.

Интерес для исследователя имеет только первая фаза смешанной культуры. В течение этой фазы среда претерпевает настолько глубокие изменения, что позднее наблюдаемые биохимические реакции могут происходить и не за счет исходного вещества. Появление роста новых микробов, наслаивающихся на господствующий вид, показывает, что опыт пора прекратить.

По большей части бесполезно продолжать его долее двух дней; иногда достаточно бывает суток, а то даже и десяти часов. Если дело идет о веществе, разлагающемся медленно, например о целлюлозе, приходится, разумеется, ждать до тех пор, пока не сделается возможным точно определить господствующую микрофлору.

Прибавим, что для создания анаэробных условий достаточно поставить чашки в эксикатор в отсутствие кислорода. В настоящей статье останавливаться на этом мы не будем.

Из всего сказанного вытекает, что за чашками надо внимательно следить с самого начала развития микробов. Мы подвергаем их 1) морфологическому исследованию, 2) химическим анализам.

Начинаем с тщательного изучения простым глазом и в лупу появляющихся колоний и стараемся дифференцировать их, что не представляет никаких трудностей: стекловидные, молочные или непрозрачные, бес- Цветные, белые, желтоватые, бурые или окрашенные в какой-нибудь Другой цвет, выпуклые или плоские, крупные или мелкие, круглые, с гладкими или с изрезанными краями, с выростами или без них и т. д., всегда находятся признаки, дающие возможность судить, принадлежат ли колонии к одному или нескольким видам. Задача сильно облегчается тем, что появляющиеся колонии обычно бывают в значительной мере однородными. Нередко они имеют даже вид чистой культуры, как можно убедиться по фотографиям, снятым с наших препаратов покойным микрофотографом Института Пастера Жаите.

После того как путем микроскопического исследования мы определили, насколько возможно быстро, формы микробов, мы переходим к выяснению характера их жизнедеятельности путем химического анализа. Мы изучаем ход биохимическогоъездействия микроба на данное соединение, не только определяя конечный продукт, но и наблюдая за всем течением происходящего па чашках процесса. Это особенно необходимо при сравнительных опытах над различными пробами почвы, потому что в таком случае конечный выход продукта ничего не скажет об интенсивности процесса. Пробы с различной активностью дадут, если предоставить им время, одинаковое количество конечного продукта. Надо, значит, следить за ходом процесса в то время, когда энергетическое вещество еще не истощилось или не было близко к истощению.

Вот химические пробы и определения, которые мы предлагаем и которые кажутся нам достаточными для выяснения функций микроба.

1.         В случае белков и аминосоединений имеет значение, разумеется, выделение аммиака. Красная лакмусовая бумажка, прикрепленная с внутренней стороны к крышке чашки Петри, покажет момент появления аммиака. Для определения его количества весь гель переносим в баллон и перегоняем в 7V/10 кислоту.

2.         В случае органических кислот за ходом процесса можно следить по степени щелочности; мы применяем соли натрия, что очень удобно благодаря их растворимости. Для количественного определения просушиваем гель, превращаем его в порошок, который извлекаем горячей водой, титруем раствор 7V/10 кислотой. Качественно за ходом процесса можно следить, определяя реакцию геля без уничтожения или нарушения культур, путем быстрого способа, который мы сейчас вкратце опишем.

Мы пользуемся четырьмя индикаторами Кларка и Лсбса: бромтимолсиним, фенол- красным, крезолкрасным, тимолсиним. Помещаем две капли индикатора в ямки фарфоровой пластины для акварельных красок. Чтобы оттенки были более ясными, предварительно слегка подкисляем индикаторы, погружая кончик платиновой иглы сначала в слабый раствор кислой фосфорнокалиевой соли, затем в индикатор. Таким образом, повторяя в случае надобности эту манипуляцию, мы достигаем более светлой, всегда приблизительно одной и той же окраски: бутылочно-зеленой для бромтимолсинего, желтовато-оранжевой для фенолкрасного, буро-желтой для крезол- красного, золотисто-желтой для тимолсинего. Для определения берем маленьким платиновым шпателем частицу геля, величиной с зерно, и опускаем ее в ямку. Если рН равняется 6,8—7,2, кусочек геля становится в бромтимолсинем изумрудно- зеленым или зеленовато-синим, не оказывая никакого действия на три остальных индикатора. Если, наоборот, имеется более высокая концентрация гидроксильных ионов, кругом геля немедленно появится яркое кольцо, а затем окрасится и вся капля. Можно будет различать гамму пяти степеней:

Темносиняя окраска в бромтимолсинем: рН от 7,3 до 7,6.

Яркокрасная окраска в фенолкрасном: рН от 7,6 до 8,2.

Темнофиолетовая окраска в крезолкрасном: рН от 8,2 до 8,6.

Стальная окраска в тимолеинем: рН от 8,6 до 9.

Темносиняя окраска в тимолсинем: рН выше 9.

3.         Для определения летучих веществ, кислот и спиртов, опускаем гель в колбу, размешиваем его с водой и определяем летучие продукты после перегонки обычными химическими методами.

4.         Для определения действия на целлюлозу, пользуемся кусочками фильтровальной бумаги или бумажной ткани (не выделанной). Число и характер окрашенных пятен, появляющихся на них, дают представление о количестве возбудителей разложения целлюлозы в данной почве. Чтобы определить количество разрушенной целлюлозы в известный промежуток времени, надо прекратить опыт в момент, когда материал сохраняет еще некоторую устойчивость. Снимаем тогда с геля остатки бумаги или ткани, кипятим их несколько минут в однопроцентной соде, промываем до исчезновения щелочной реакции и высушиваем до постоянного веса.

5.         Чтобы констатировать усвоение газообразного азота, подвергаем гель сжиганию по Кьельдалю.

6.         Образование нитритов проследить крайне легко с самого его начала и до конца. Делаем это, бросая через определенные промежутки времени частицы геля в несколько капель жидкости Троммсдорфа, где появляется сначала легкая лазурная дымка, а затем голубое пятно, которое постепенно темнеет и доходит до темносинего цвета. Градации достаточно показательны, для того чтобы можно было судить о ходе процесса. Затем начинаем делать пробы с реактивом Несслера до тех пор, пока гель не дает больше ни малейшей желтой окраски; это достаточно точный показатель того, что окисление аммиачного азота закончено. Такие опыты довольно часто позволяют также сравнить активность различных проб почвы. Однако метод, недавно описанный нами в сообщении Академии Наук , представляется более показательным.

7.         Образование нитратов проследить труднее. Реакция Троммсдорфа. достигающая максимума в присутствии нитритов, исчезает не постепенно, а почти сразу, вместе с последними следами нитритов. Она показывает, значит, только конечный момент. После ее исчезновения положительная реакция с сернокислым дифениламином свидетельствует о присутствии нитратов.

После того как метод был разработан во всех подробностях, надо было применить его к пробам, представляющим наибольшее разнообразие с микробиологической точки зрения. Окончательную оценку нового метода можно было сделать, разумеется, только путем сравнительного применения его *к таким пробам. Это было единственным средством убедиться в его действительности, вследствие того что мы имеем только смутные, неполные представления о микрофлоре естественной среды и. нам не удалось еше установить для нее никакого стандарта.

В нашем распоряжении находились два участка опытного поля; один из них регулярно обрабатывался и удобрялся в течение десятка лет; развитие микробов шло там полным ходом за счет растительных остатков и удобрения; мы назовем его Щ. (сокращенное «шпалерник»). Другой, который мы будем обозначать К. (сокращенное «контроль»), был, наоборот, лишен всякого удобрения и всякой растительности в течение того же промежутка времени; он содержался без растительности, время от времени разрыхлялся и оставался под черным паром; за последние годы он стал очень беден азотом и фосфорной кислотой, а также перегноем, что было видно уже по его цвету, гораздо более светлому, чем у нормально обрабатываемых соседних участков. Из этого следует, что его микрофлора, несомненно, должна была быть истощенной, результаты чего не могли пе сказаться на плотности и активности микробного населения.

При параллельном изучении двух указанных почв можно было поставить два вопроса: 1) найдем ли мы те же формы с теми же функциями в обоих пробах; 2) приводит ли долгое отсутствие удобрения к изменению активности микрофлоры.

Прежде чем описывать опыты, надо подчеркнуть, что ни их построение, ни их приемы, ни сделанные из них выводы не могут считаться окончательными Их следует рассматривать как первую попытку применения нового метода микробиологического анализа почвы. Совершенно очевидно, что прежде чем выработать наилучший способ такого анализа для всеобщего применения, будут необходимы многочисленные опыты. Мы думаем, однако, что эта, стояшая в порядке дня, работа должна основываться на принципах, изложенных в настоящей статье.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ