Жизнь  в пробирке  

Все опытки культивировать вирусы на искусственных питательных средах оканчивались неудачей. Следовательно, нужно было научиться выращивать живые клетки в пробирке. Длительные поиски увенчались победой — был создан метод культуры тканей.

Культура ткани... Не правда ли, не очень понятное сочетание слов? А вирусологу, поставившему перед собой цель выяснить, что происходит с клеткой, на которую напал вирус, эти два слова скажут многое. Этот метод сделал доступным изучение инфекционного процесса на клеточном уровне. Ведь клетки — это та единственная среда, попав в которую вирус как бы оживает и начинает воспроизводить себе подобных.

Если взять кусочек ткани, поместить его в специальную питательную среду и поставить при температуре 35—37°, то клетки начнут активно делиться. Если их время от времени промывать и добавлять свежую питательную среду, то они будут размножаться неопределенно долгий срок.

Известны клетки, которые культивируются уже много лет во всех вирусологических лабораториях мира. Например, культура Хе Ла. Она была получена в 1952 году из раковой опухоли и названа так по инициалам больной, умершей через два года после операции. Много лет живет культура клеток, выделенная в 1955 году из раковой опухоли гортани человека, другая культура получена из ангио- саркомы (злокачественная опухоль сосудов) человека; есть культура из клеток сердца обезьяны.

В вирусологии используется несколько способов культивирования тканей. Можно выращивать клетки в жидкой среде во взвешенном состоянии или, прикрепив кусочки ткани к стенкам стекла сгустком плазмы, а сверху омывая питательной средой. Есть и другие пути, но основным считается способ получения однослойной культуры из клеток, изолированных одна от другой. Для получения такой культуры измельченную ткань обрабатывают раствором пищеварительного фермента трипсина при температуре 35—37°. Трипсин разрушает связи между клетками, и в пробирке образуется однородная взвесь клеток. Ее промывают, чтобы удалить трипсин, а потом разводят специальным составом, содержащим эмбриональный экстракт, сыворотку крови, солевой раствор и антибиотики. После этого взвесь разливают в пробирки или специальные чашки, закрывают пробками и помещают в термостат при температуре 37°. В этих условиях клетки прикрепляются к стеклу, а затем начинают размножаться, образуя однослойный пласт.

Посмотрите, как выглядят клетки культуры ткани под обычным микроскопом. Вы можете легко определить в них все основные компоненты — ядро, ядрышки, цитоплазму и оболочку. А при большом увеличении, которое можно получить с помощью электронного микроскопа, легко различить митохондрии и рибосомы в цитоплазме клетки и хроматин в ядре.

Если такую культуру заразить вирусом, то происходящие в ней процессы можно наблюдать под микроскопом.

Возбудителей с помощью шприца вводят через скорлупу в зародыш на восьмой-девятый день его развития. Яйцо ставят в термостат, а затем производят пересев на новые зародыши. Таким образом можно получить большие количества вирусов.

Довольно просто культивировать в лаборатории бактериофаги. Для них «кормом» являются бактерии, хорошо растущие на искусственных питательных средах.

Оказалось, что формы взаимодействия вируса и клетки чрезвычайно сложны и многообразны. В одних случаях вирусы играют роль «убийц», в других они действуют скрытно, проникая внутрь клетки и длительное время не проявляя своего вредоносного действия.

Следующий цикл заражения — и число вирусных частиц возрастает до 88000000000 частиц, каждая из которых способна (вернемся к нашим фотографиям) убить клетку. Да, с вирусами шутки плохи! Никакой другой организм не может дать такое бесчисленное потомство за столь ничтожный срок. Такую же картину могут вызвать и возбудители оспы, полиомиелита, ящура. Вот эта-то разрушительная способность вирусов и была использована для определения их числа. Если небольшое количество их добавить в чашки со сплошным слоем клеток, то каждая вирусная частица произведет разрушение в том месте, куда она попала. Мертвые участки, которые обычно называют негативными колониями — «пятнами», или «бляшками», будут хорошо видны. В одних случаях они напоминают чернильные пятна на промокашке, в других для их выявления надо прибавить краску, которая окрасит только живые клетки, и будут видны контуры мертвых участков.

Нормальная культура ткани почки человека:а — при увеличении в 100 раз; б — при увеличении в 1000 раз; хорошо видны ядра, ядрышки и ядерная оболочка; в — при увеличении в 30 ООО раз; часть клетки под электронным микроскопом; в цитоплазме видны митохондрии и рибосомы, в ядре — хроматин.

Бляшки, полученные после заражения клеток разными вирусами, обычно отличаются одна от другой. Форма их зависит от размеров самого вируса. Более крупные образуют мелкие бляшки, а мелкие легко разбегаются по сторонам, в результате чего возникают крупные бляшки.

Сложнее дело обстоит с вирусами, которые медленно разрушают клетки. Этот процесс занимает иногда много дней, а то и недель. В таких случаях исследователь должен набраться терпения или воспользоваться методами, о которых мы будем говорить дальше.

Иногда вирусные частицы накапливаются внутри клеток в таких количествах, что могут быть видны в обычный оптический микроскоп. Образуются так называемые включения. В подходящих условиях включение может ожить, ведь оно состоит из вирусов.

При гриппе, бешенстве, оспе такие включения находят в цитоплазме клеток, а при энцефалите, желтой лихорадке и полиомиелите они обнаруживаются в ядре. При некоторых вирусных инфекциях тельца включений обнаруживаются и в ядре и в цитоплазме. Включения отличаются одно от другого по форме, размерам, внутреннему строению и отношению к окраске.

Существуют и другие способы обнаружить вирусы. Например, можно заразить какое-нибудь чувствительное лабораторное животное (мышь, морскую свинку, кролика). После введения возбудителя животное заболевает, и по картине болезни часто можно судить о том, какой вирус ее вызвал.

Если взять кровь у переболевшего кролика, то в ней легко обнаружить особые белки (антитела), которые образовались в ответ на внедрение вируса. Они обладают специфической способностью обезвреживать (нейтрализовать) только тот вирус, который их «породил». Такое свойство антител позволило разработать целый ряд очень чувствительных и точных реакций', названных иммунологическими. Они используются в вирусологии очень широко.

Представьте себе простейший случай: известная сыворотка, например против кори, смешивается с неизвестным возбудителем. Этой смесью заражают чувствительное к кори животное. Если животное не заболевает, значит, это был вирус кори, его нейтрализовала сыворотка. Можно и наоборот, имея в руках известный вирус, определить наличие в крови больного соответствующих антител и тем самым поставить диагноз заболевания.

Зная это, один вирусолог решил проверить, а правильно ли 20 лет назад больным ставился диагноз «грипп»?

Ведь, наверное, каждый из наших читателей много раз болел «гриппом». Между тем, это не всегда настоящий грипп. Часто и в наши дни так называют похожие на него болезни, вызванные другими вирусами.

Ученый проделал простой опыт. Он взял сыворотки, которые были получены из крови больных 20 лет назад и хранились в холодильнике, и посмотрел, не содержат ли они антител против возбудителей сходных с гриппом болезней, которые были открыты лишь в последние годы. Оказалось, что во многих случаях сыворотки содержали такие антитела в большом количестве. Это означало, что заболевание, которое раньше считали гриппом, на самом деле не было им. Оно было вызвано вирусами, о существовании которых в то время еще не подозревали.

Уже давно обнаружено, что многие вирусы способны оседать на красных кровяных шариках (эритроцитах) и склеивать их между собой. Это явление получило название реакции гемагглютинации, которая широко применяется в лабораториях. С помощью такой реакции легко определить концентрацию возбудителей в исследуемом материале. Для этого надо добавить к вирусам взвесь эритроцитов. Склеивание произойдет только там, где есть вирус. Эту реакцию можно использовать для диагностики. Ставят опыт в этом случае несколько иначе. Сначала неизвестный вирус смешивают с известными сыворотками (например, сыворотками против гриппа, полиомиелита, оспы и т. д.), затем к этой смеси прибавляют эритроциты. Естественно, что там, где реакция не идет, сыворотка соответствует вирусу, то есть происходит, как говорят, задержка гемагглютинации.

Если эритроциты с осевшим на них вирусом поместить в электрическое поле, то они начнут перемещаться к одному из полюсов, но скорость их перемещения будет гораздо меньше, чем у свободных эритроцитов. Этот способ довольно сложный; для обнаружения вирусов его не используют, однако он нашел применение в теоретических исследованиях для сравнения разных вирусов.

вирусы и кино

Все те способы изучения вирусов, о которых мы говорили, далеко не идеальны. Ну, а можно ли увидеть, как вирусы убивают и разрушают клетки в динамике — так, как это происходит на самом деле? И здесь ученые вспомнили о кино. Что, если в объектив микроскопа вместо глаза исследователя будет смотреть кинокамера? Ведь она может заниматься этим непрерывно. Для этого вирусологи в содружестве с инженерами должны были преодолеть немало технических трудностей, после этого стало возможно использовать кино для изучения медленно протекающих и неуловимых доселе биологических процессов. Полученные результаты превзошли самые смелые ожидания.

Так был снят научный фильм об агрессивных свойствах вируса полиомиелита. Можно было видеть, как нормальные незараженные клетки активно росли и делились в специальных условиях до встречи с вирусом. Вскоре после заражения клетки начинают сморщиваться и разрушаться, а через 15 часов на месте культуры остались лишь бесформенные остатки погибших клеток.

Иногда после внесения вирусов происходит скучивание и слияние клеток, образуются многоядерные структуры, которые называются симпластами. На кадрах из другого кинофильма вы можете увидеть, как это происходит. Перед вами одна и та же группа клеток перед встречей с вирусом свинки через каждые 30 минут после заражения. Посмотрите внимательно. Незараженные клетки изолированы одна от другой, хорошо видны клеточные оболочки. Через 30 минут после контакта с вирусом начинается слияние клеток. Между соседними клетками образуются своеобразные перемычки и мостики. Затем клеточные оболочки исчезают и образуется симпласт, насчитывающий сотни ядер. Эта структура мало жизнеспособна, она быстро погибает.

Есть вирусы, которые вызывают болезни клеток с длительным хроническим течением. Такие клетки долго выглядят здоровыми, они активно делятся и перемещаются. Затем их ядра набухают, движения замедляются и постепенно клетки погибают. С помощью кино можно наблюдать, как происходит злокачественное перерождение клеток после встречи их с опухолеродными вирусами. Для измененных клеток характерно стремление к очень активному делению. Они образуют очаги бесформенного роста. Такие же процессы, по-видимому, происходят и в организме при образовании опухолей.

Мы рассказали лишь о некоторых результатах применения метода микрокиносъемки для изучения зараженных клеток. Очень важной особенностью этого метода является возможность многократного просмотра отснятых опытов на экране. Это позволяет выявлять трудно заметные, но порой очень важные особенности процесса и устанавливать связь между ними. Союз кино и вирусологии многое обещает в будущем.