|
Молочнокислые бактерии, обладающие
производственно-ценными свойствами, например высокой активностью свертывания
молока, способностью образовывать диацетил, в природных источниках встречаются
редко. Интенсифицировать сквашивание молока и улучшигь качество кисломолочных
продуктов можно при использовании молочнокислых бактерий с повышенной
биохимической активностью. Получение таких штаммов осуществляется
воздействием сильно действующих мутагенных факторов.
Популяция культуры состоит из большого числа клеток,
различающихся по биохимической активности: Реакция клеток в ответ на
воздействие внешних факторов неодинакова: одни клетки погибают, другие
изменяют свои морфологические, биохимические и физиологические свойства. Эти
особенности микроорганизмов обусловливают их изменчивость и позволяют
получить разнокачественные особи с необходимыми свойствами.
Воздействие мутагенных факторов состоит из двух основных
этапов воздействия на клетки микроорганизмов сильно действующего мутагенного
фактора и последующего отбора высокоактивных вариантов. Этот метод селекции
является высокоэффективным и доступным для практического использования при
селекции промышленных штаммов.
Наследственные изменения (мутации) свойств микроорганизмов
могут происходить под влиянием химических и физических факторов (ионизирующее
излучение и ультрафиолетовые лучи). При радиационной селекции используют
преимущественно гамма-лучи и быстрые нейтроны, которые дают лучший мутагенный
эффект. Однако их использование для получения промышленных штаммов
ограничено. Ультрафиолетовые лучи с длиной волны 2650 нм обладают также
хорошим мутагенным действием, так как лучи этой длины волны избирательно
поглощаются молекулами ДНК. Ультрафиолетовые лучи вызывают возбуждение
молекулы, что в последующем приводят к их химическому изменению.
Химические мутагены более эффективны по количеству
мутаций, чем физические, и часто обладают более тонким и специфическим
действием на клетку бактерии. Химические мутагены дают значительно больше
полезных мутаций, чем физические, являясь в то же временее летальными. В
качестве химических мутагенов используют нитрозосоединепия, формальдегид,
уретан, этиленимин, окись этилена, диэтилсульфит, диметилсульфит, саркализин
и др.
Применяют также сочетание физических и химических
факторов.
Для получения мутантов различных видов молочнокислых
бактерий используют нитрозосоединепия, этиленимин, ультрафиолетовые лучи,
гамма-лучи, рентгеновские лучи и быстрые нейтроны.
Для получения мутантов среди культур отбирают штаммы,
популяция которых характеризуется средней изменчивостью, коэффициентом
вариации от 10 до 20%. Исследование вариантов популяции культуры по энергии
кислотообразования и определение коэффициента вариации культуры рассмотрены в
главе 8.
Для наращивания клеток используют гндролизованное молоко с
добавлением 2,5% Дрожжевого автолизата или плотную питательную среду (2%
агара), приготовленную из гидролизованного молока (с 2,5% дрожжевого
автолизата); среды после стерилизации должны иметь рН 6,8—7,0 и быть
прозрачными.
Комбинированное воздействие этиленимина и ультрафиолетовых
лучей на штаммы S. lacis. Отобранные штаммы S. lacis (17—18-часовые,
выращенные на стерильном обезжиренном молоке) засевают в гндролизованное молоко
с дрожжевым автолизатом, термостатируют при оптимальной температуре роста в
течение 17—18 ч. Полученную культуру наносят на скошенную плотную питательную
среду, посевы термостатируют при оптимальной температуре. После этого клетки
смывают с поверхности среды стерильным физиологическим раствором. Суспензию
клеток помещают в стерильные центрифужные стаканчики (пробирки), которые
закрывают полиэтиленовой пленкой, закрепляя ее резинкой. Стаканчики
(пробирки) центрифугируют, сливают надосадочную жидкость, встряхивают осадок,
добавляют стерильную дистиллированную воду и вновь центрифугируют. Такую
операцию повторяют 2 раза. В результате получают клетки, отмытые от остатков
среды. Из отмытых клеток в стерильной дистиллированной воде готовят суспензию
клеток, содержащую от 500 до 1000 тыс. клеток в 1 мл по стандарту мутности.
Предварительно проверяют совпадаемость содержания клеток по стандарту
мутности с данными, полученными при посеве на плотную питательную среду.
При комбинированном воздействии этиленнмина и ультрафиолетовых
лучей вначале суспензию клеток подвергают действию этиленнмина, а затем
ультрафиолетовых лучей. Раствор этиленнмина готовят па дистиллированной воде
перед использованием. Для этого содержимое ампулы (0,1 мл) переносят в
стерильную мерную колбу на 200 мл, добавляя дистиллированную воду до метки.
Этот раствор имеет концентрацию 1 :2000. Затем в стерильную пробирку отбирают
0,65 мл раствора этиленнмина, 1,35 мл стерильной дистиллированной воды и 8 мл
суспензии клеток. Получают концентрацию этнленимина в смеси 0,033%. Смесь
помещают в термостат, где выдерживают определенное время ( 63).
Для снятия остаточного действия этиленнмина смесь
центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, клетки встряхивают и добавляют
дистиллированную воду (10 мл). После перемешивания смесь помещают в чашки
Петри (по 5 мл), которые устанавливают в бокс, где их открывают и облучают
ультрафиолетовыми лучами (лампой БУВ-15 на расстоянии 30 см в течение 15—45 с). При облучении содержимое чашки перемешивают равномерным вращательным
движением.. Чашки с облученной суспензией закрывают светонепроницаемой
бумагой и оставляют на 1 ч при комнатной температуре.
По окончании выдержки делают глубинный или поверхностный
посев суспензии клеток на плотную питательную среду. Разведение суспензии
берут из расчета, чтобы на чашке выросло 10—20 колоний. Чашки с посевами
выдерживают в термостате при оптимальной температуре в течение 3 сут, а затем
дополнительно 1—2 сут при комнатной температуре.
От каждого штамма выделяют не мегёё 50-7100 колоний (вари-
антор) в стерильное обезжиренное молоксэ, термостатируют при оптимальной
температуре роста и отбирают варианты, свертывающие молоко не более чем за
24 ч, остальные отбраковывают. Отобранные варианты, перевивают петлей в
стерильное обезжиренное молоко 5—7 раз через 20—30 дней. При этом отбирают
все варианты, свертывающие молоко не более 17 ч. У наиболее активных
вариантов (свертывающих молоко до 17 ч) проверяют продолжительность
свертывания пастеризованного молока : и органолептические показатели по
сравнению с исходным штаммом (при внесении 3% культуры). Отбирают варианты,
свертывающие- молоко не менее чем на 30% быстрее исходного штамма, образующие
; е молоке плотный колющийся сгусток и чистый кисломолочный вкус. После 2—3
пересадок в стерильное обезжиренное молоко варианты С вновь проверяют на
длительность свертывания пастеризованного мо- : лока и органолептические
показатели по сравнению с исходным £ штаммом. Такой отбор проводят 2—3
раза.
Этиленимин является производным иприта, легко воспламеняю-
р щимся веществом. Поэтому при работе с этиленимином необходимо пользоваться
защитными очками, резиновыми перчатками и смочен- 5 ной водой марлевой
повязкой (последняя только при вскрытии чампулы и приготовлении раствора
этйленимина). Вся работа по £ вскрытию ампулы, приготовлению раствора
этилениминя и посеву проводится без спиртовки или газовой горелки в
настольном боксе, Т..предварительно облученном бактерицидной лампой. При
работе с 'УФ-лучами работают в защитных очках и резиновых перчатках. Бокс гнри
обработке бактерицидной лампой и облучении УФ-лучами суспензии клеток должен
быть защищен от действия дневного света. Для этого стенки и крышку бокса
закрывают светонепроницаемой бумагой или белой тканью.
Культуральную жидкость центрифугируют в стерильных
центрифужных стаканчиках, после чего сливают надосадочную жидкость.
Бактериальные клетки встряхивают, добавляют стерильную дистиллированную воду
и вновь центрифугируют. Такую операцию повторяют дважды.
Отмытые клетки ресуспендируют в 1%-ном буферном растворе
рН 6,0 (Na2HP04 и КН2Р04) N-нитрозоэтилмочевины (НЭМ). Суспензию
клеток готовят так, чтобы их содержание в 1 мл было равно 500—1000 клеток.
Колбочку, содержащую 2 мл суспензии клеток, помещают на
качалку в термостат и выдерживают там определенное время. Для снятия
остаточного действия мутагена суспензию клеток центрифугируют. Надосадочную
жидкость сливают, клетки ресуспендируют в 100 мл бульона (гидролизованиое
молоко с 2,5% дрожжевого автоли- зата), подращивают в термостате при
оптимальной температуре роста.
Затем суспензию клеток высевают на плотную питательную
среду (глубинный или поверхностный посев). Разведение суспензии берут из
такого расчета, чтобы на чашке вырастало 20--30 колоний. Чашки с посевами
выдерживают в термостате, а затем дополнительно при комнатной температуре.
Выделение колоний, исследование вариантов и отбор активных вариантов проводят
так же, как и при комбинированном воздействии этиленнмина и УФ-лучей.
Среди активных вариантов, полученных при комбинированном
воздействии этиленнмина и УФ-лучей и воздействии НЭМ, отбирают мутанты,
имеющие гомогенную популяцию клеток (коэффициент вариации до 10%). Эти
мутанты являются наиболее стойкими к сезонным изменениям качества молока и
ценными для использования в закваска. Отбирают мутанты, свертывающие молоко
через 3—4, 5 ч и образующие плотную колющуюся консистенцию и чистый
кисломолочный вкус.
НЭМ является летучим веществам, раствор которого нестоек.
Навеску НЭМ следует брать на аналитических весах; раствор приготовляют перед
употреблением и не хранят. Раствор НЭМ отбирают пипеткой с грушей или
опусканием пипетки в раствор.
Комбинированное воздействие нитрозосогдинекмй и
ультрафиолетовых лучей на штаммы S. cremoris и S. lacis subsp. aceoinicus.
Для получения мутантов S. cremoris и S. lacis subsp. aceoinicus с повышенной
биохимической активностью применяют комбинированное воздействие
нитрозосоединений и ультрафиолетовых лучей (УФ-лучей). Так, для получения
мутантов S. cremoris с повышенной активностью свертывания и улучшенной
консистенцией используют комбинированное воздействие N-нитрозоэтилмочевины и
УФ-лучей. При этом в зависимости от концентрации н дозы мутагена получают
культуры с колющейся или вязкой консистенцией.
Для получения мутантов S. lacis subsp. aceoinicus с
повышенной активностью свертывания и образованием ароматических веществ
используют комбинированное воздействие N-ннтрозобнуретмочевины или
N-нитрозометилмочевииы и УФ-лучей.
Отбор и подготовку культур S. cremoris и S. lacis subsp.
aceoinicus, а также получение мутантов при комбинированном воздействии
нитрозосоединений и УФ-лучей ведут так же, как и S. lacis.
Исследования показали, что воздействием ряда химических
мутагенов (иногда в сочетании с УФ-лучами) возможно повышать активность
свертывания молока у культур S. lacis, S. cremoris, S. lacis subsp.
aceoinicus и образование ароматических веществ у последнего и получить
стойкие мутанты.
Мутанты S. lacis, S. cremoris и S lacis subsp. aceoinicus
находят широкое применение при производстве кисломолочных продуктов.
При воздействии сильно действующих факторов возможно не
только повысить биохимическую активность культуры, но и изменить видовые
свойства культур. Так, из культур S. lacis subsp. aceoinicus получены
мутанты, по своим свойствам идентичные S. lacis subsp. diaceylacis. Имеется
достаточно экспериментальных данных, указывающих на возможность получения
стойких мутантов молочнокислых бактерий воздействием химических и физических
факторов, которые могут быть использованы в производстве.
Воздействие адаптации на молочнокислые бактерии.
Адаптация— это повышение резистентности микроорганизмов к ряду химических
веществ или физических факторов путем- постепенного увеличения в среде
обитания этого или иного вещества, повышения или снижения температуры
развития. Селекция микроорганизмов адаптацией состоит кз двух основных
этапов: повышения резистентности культуры и отбора улучшенных вариантов.
В настоящее время имеется достаточно данных, указывающих,
что путем адаптации можно повысить резистентность молочнокислых бактерий к
антибиотикам, химпрепаратам, поваренной соли и т. д.; установлена возможность
адаптации молочнокислых бактерий к повышенной или пониженной температуре
развития и к высушиванию.
Получены культуры молочнокислых бактерий, резистентные к
антибиотикам — низину, пенициллину и стрептомицину, а также культуры
мезофильных молочнокислых стрептококков и молочнокислых палочек, устойчивые к
сушке ( 68). Установлена возможность повышения резистентности культур L.
acidophilus и L. bulgaricus к желчи через несколько циклов последовательного выращивания
в средах, содержащих желчь.
Улучшенные формы молочнокислых бактерий, полученные путем
адаптации, находят применение в производстве традиционных кисломолочных
продуктов, а также лечебно-профилактических препаратов, содержащих
молочнокислые бактерии.
|