Структура вируса гриппа. Рибонуклеиновая кислота. Состав вирусной частицы. Белки. Липиды. Углеводы

  

Вся библиотека >>>

Содержание книги >>>

 

Медицинская литература

Вирусы гриппа и грипп


Раздел: Медицина 

 

Структура вируса гриппа

 

 

П. В. ШОППИН И Р. В. КОМПАНС (P. W. CHOPPIN, Я. W. CQMPANS)

 

I. ВВЕДЕНИЕ

Изучение вируса гриппа в течение длительного времени находилось «а передовом рубеже структурных исследований з вирусологии. Вирус гриппа одним из первых был изучен : помощью электронной микроскопии (Taylor et al., 1943), и при использовании именно этого объекта в качестве модели было "оказано, что некоторые вирусы образуются путем отпочко-зания от .клеточных мембран (Murphy, Bang, 1952). Введение з экспериментальную вирусологию метода негативного контрастирования в большей степени стимулировало структурные исследования вирусов вообще, а вирус гриппа явился объектом наиболее ранних и ярких работ (Home et al., 1960; Hoyle et al., 1961), в которых было показано наличие у вируса оболочки с включенными в нее поверхностными «шипами» и внутреннего спирализованного нуклеокапсида. В последние годы вирус гриппа изучали с помощью многих физических и химических (методов, в результате чего этот вирус является в настоящее время одним из наиболее изученных оболочечных вирусов с точки зрения их структурной организации.

Огромный интерес к структуре и сборке вирусов гриппа связан с биологическим значением заболевания, которое вирусы гриппа вызывают у человека и животных. Кроме того, вирусы гриппа, как и другие оболочечные вирусы, являются лрекрасной моделью для изучения 'клеточных мембран. Возможность использования вирусов в качестве такой модели обусловлена тем, что вирусные частицы обладают внешней оболочкой, которая формируется из клеточной мембраны и морфологически ей идентична. Удобство же использования оболочечных вирусов для этой цели заключается в том, что они представляют собой простую модель, (которую можно получить в высокоочищенной и гомогенной форме для физических, химических и биологических исследований. Вирионы гриппа содержат в своем составе лишь небольшое число вирусспецифических белков, состав 'которых может изменяться при селекции различных штаммов и мутантов и которые во многих случаях могут быть выделены в биологически активном состоянии. Липидный и углеводный состав вирионов гриппа можно изменить, варьируя тип хозяйских клеток, поскольку эти .компоненты вирусных мембран определяются в основном клеткой-хозяином. Удобство использования вирусов в качестве моделей мембран подчеркивали 1многие авторы (Choppin et al., 1971; Lenard, Compans, 1974; Choppin, Com-pans, 1975; Compans, Choppin, 1975).

Настоящая глава посвящена описанию общего состава и морфологии частиц вируса гриппа и взаимодействия различных его компонентов. В последующих главах (см. гл. 3, 6, 10 и 12) дано детальное описание биологических и иммунологических свойств различных компонентов вирусной частицы, а. также структуры нуклеиновой кислоты и некоторых индивидуальных белков. В литературе уже имеется несколько обзоров с изложением работ по изучению структуры и сборки вирионов гриппа (Compans, Choppin, 1971, 1973, 1975; Choppin et al., 1972; Schulze, 1973; Laver, 1973; White, 1974; Choppin, 1975).

 



СОСТАВ ВИРУСНОЙ ЧАСТИЦЫ

А. ОБЩИЙ ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И ОТНОСИТЕЛЬНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАССА

Химический состав вирионов гриппа не может быть приведен абсолютно точно потому, что вирусная популяция гете-рогенна, а также потому, что состав вирусной частицы в некоторой степени (для липидов и углеводов) определяется клеткой-хозино1М (см. далее). Тем не менее приблизительный химический состав был определен: 0,8—1,1% РНК, 70—75% белка, 20—24% липидов и 5—8% углеводов (Ada, Perry, 1954; Frommhagen et al., 1959; Blough et al., 1967). Вирусная популяция обычно содержит большое число неинфекционных «неполных» вирусных частиц и, таким образом, приведенное содержание РНК отражает нижний предел величины, характерной для инфекционных вирионов, которые содержат полный набор фрагментов вирусной РНК- Тщательный анализ вирусных частиц, культивированных на клетках почки быка линии MDBK, для которых характерен высокий выход инфекционных частиц с низким по сравнению с другими клетками выходам дефектных вирионов (Choppin, 1969), 'наряду с дополнительным отделением полных частиц в градиенте плотности, по-видимому, должен дать уточненную величину содержания РНК в вирусной частице.

Определение точного значения относительной -молекулярной массы 'вирионов гриппа также осложняется гетерогенностью вирусной популяции, получаемые величины варьируют в широких пределах. С помощью икжтронно-микроекопического и седиментационного методов анализа получены значения относительной молекулярной массы от 270• 106 до 290-106 (Lauffer, Stanley, 1944; Scharp et al., 1945; Schramm, 1954). Низкое значение (151 - К)6) было получено для вируса FPV на основе определения коэффициентов диффузии и седиментации (Schafer et al., 1952; Schramm, 1954), а более высокое (360-106) —на основе измерения содержания белка в вирионе и подсчета числа частиц с помощью электронного микроскопа '(Reimer et al., 1966). В свяви с тем что размеры вирусных частиц варьируют, невозможно получить величину относительной молекулярной (массы, одинаковую для всех вирионов вирусной популяции. Кроме того, в случае оболочечных вирусов, форма которых непостоянна, а сами вирионы легко разрушаются, трудно ожидать высокой точности при получении результатов с помощью таких методов, как подсчет частиц и определение коэффициентов седиментации. Хотя величина массы вирионов гриппа варьирует по объективным причинам и нельзя привести одного и того же значения для всех вирусных частиц, и настоящее время между различными лабораториями имеется согласованное мнение о пределах величин содержания РНК и белков в вирусной частице.

Б. РИБУНОКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА

Содержание РНК в вирионах гриппа равно 0,8—1,1% (Ada, Perry, 1954; Frisch-Niggemeyer, Hoyle, 1956; Frommhagen et al., 1959). Поскольку в этих исследованиях не была точно установлена степень чистоты использованных вирусных препаратов, приведенная выше величина оставляет почву для некоторых сО(Мнений. Так, по данным Frisch-Niggemeyer и Hoyle (1956), содержание РНК в изолированном нуклеопро-теиде вируса гриппа равно 5,3%, в то время как, согласно более поздним исследованиям, эта величина составляет 10— 12% (Pons et al., 1969; Krug, 1971). Это указывает на невысокую точность определения содержания РНК в вирионе в ранних работах. Данная в этих работах (на основе определения содержания РНК в вирионе) величина для размера вирусного генома — приблизительно 2-Ю6 (Frisch-Niggemeyer, 1956)—также значительно ниже величины 4-Ю6—5-Ю6, определенной с помощью электрофореза вирусной РНК в геле.

Известные в настоящее время биологические и биохимические данные указывают на то, что РНК вируса гриппа су-

шествует в вирионе в виде нескольких фрагментов. Полное доказательство этого положения мы здесь не приводим, поскольку этот вопрос будет подробно обсужден в гл. 6. При , электрофорезе вирусной РНК в полиакриламидном геле наблюдается шесть или семь фрагментов с относительной молекулярной массой в пределах от 3,5-105 до 10-105дальтонов1 (Skehel, 1971; Lewandowski et al., 1971; Bischop et al, 1971). Установлено, что размер фрагментов дискретен, а изучение их концов указывает на то, что возникновение фрагментов не связано с фрагментацией одной молекулы РНК или с ее расщеплением нуклеазой (Young, Content, 1971; Lewandowski et al., 1971). Размеры индивидуальных фрагментов РНК хорошо коррелируют с относительной молекулярной массой вирускодируемых полипептидов, и в связи с этим можно высказать предположение, что каждый фрагмент генома кодирует один вирусный полипептид. Вирусная РНК входит в состав внутривирусного спирализованного рибонуклеопротеида и, как будет показано ниже, были обнаружены дискретные по размерам рибонуклеолротеиды, содержащие различные фрагменты вирусной РНК-До настоящего времени не было получено убедительных доказательств существования ковалентной связи или специфической агрегации фрагментов вирусной РНК в вирионе или в инфицированной клетке. Агрегаты с относительной молекулярной массой около 3-Ю6 были получены при экстракции РНК из вирионов в присутствии двухвалентных .катионов. При тепловой обработке эти агрегаты переходили в медленно седиментирующие структуры (Agrawal, Bruening, 1966; Pons, 1967). В одном из электронно-микроскопических исследований сообщалось об обнаружении молекул РНК с относительной молекулярной массой 3-Ю6, диссоциирующих на меньшие по размерам молекулы при рН 3,0 (Li, Seto, 1971). Однако наблюдаемая гетерогенность не является доказательством того, что имеется специфическая агрегация всех фрагментов вирусного генома.

Содержание в вирионе различных фрагментов РНК варьирует. Несколько пассажей вируса гриппа с высокой множественностью заражения приводят к репродукции неинфекционных частиц, что отражается в низком отношении инфек-ционности препаратов к их гемагглютинирующей активности (von Magnus, 1964). Такой вирус называют неполным. Он характеризуется отсутствием самого большого по размерам фрагмента РНК и увеличенным содержанием низкомолекулярных гетерогенных фрагментов (Pons, Hirst, 1968; Dues-berg, 1968; Choppin, Pons, 1970). Некоторые различия наблю-

даются в седиментационных профилях РНК, выделенных из различных штаммов, а также из вирусов одного штамма при разном времени культивирования и различной множественности заражения (Barry et al., 1970). Такого рода различия могут отражать неодинаковую скорость синтеза разных фрагментов вирионной РНК; при этом низкомолекулярные фрагменты, вероятно, синтезируются с большей скоростью, чем большие по размерам.

В. БЕЛКИ

1. Число и функции полипептидов

Различные полипептиды, обнаруживаемые в вирионах гриппа, будут описаны здесь кратко в связи с тем, что их морфология и взаимосвязь в вирионе будут обсуждаться в разделе III настоящей главы. Кроме того, свойства некоторых из этих белков, в частности гематглютинина и нейрами-нидазы, будут детально обсуждены в последующих главах книги [синтез (см. гл. 8), химические, -биологические (см. гл. 3) и иммунологические (см. гл. 10 и 12) свойства]. Хотя вирион гриппа и формируется путем отлочковывания от цито-плазматических мембран клетки-хозяина, хозяйские полипеп-тиды не присутствуют в вирионе в качестве структурных белка различных клеточных культурах (Compans et al., 1970a; Schulze, 1970), а также отсутствие общих белков в вирусах гриппа и других оболочечных вирусах, выращенных «а клетках одного типа. Кроме того, все полипептиды, входящие и состав вириона гриппа, могут быть обнаружены в инфицированной клетке в процессе синтеза как новые белковые образования (Lazarowitz et al., 1971; Skehel, 1972; Klenk et al., 1972b; Compans, 1973a).

В связи с тем что три белка, входящих в состав вириона гриппа, а именно белок нуклеокапсида, гемагглютинин и лсйраминидаза, можно идентифицировать иммунологически (см. гл. 10 и 12), начиная с 60-х годов, основное внимание было привлечено к исследованию именно этих белков. Ранние работы с использованием электрофореза также показали наличие трех основных полипептидов, которые были идентифицированы с этими тремя антигенами. Однако после введения в экспериментальные исследования электрофореза в поли-акрщшмидном геле, обладающего высокой степенью разрешения белков, а также методов введения радиоактивных меток в аминокислоты и сахара (для идентификации белков и гликопротеидов) было обнаружено, что в вирионе гриппа присутствует по крайней мере семь структурных полипептидов с относительной молекулярной массой приблизительно от 25 000 до 94 000 (Compans et al., 1970a; Schulze, 1970). В настоящее время существует согласованное ;мнение о составе полипептидов в вирионах гриппа (Haslam et al., 1970a; Corn-pans et al., 1970a; Schulze, 1970; Skehel, Schild, 1971; Lazarowitz et al., 1971, 1973a; Klenk et al., 1972a). На 1 приведен электрофоретический профиль полипептидов вируса гриппа типа А (штамм WSN), выращенного на первичных клетках почки макаки резуса. В табл. 6 представлены данные о полипелтидах вируса гриппа, существование которых в настоящее время твердо установлено, а также сведения об их функциональной роли и локализации в вирионе (если это известно). Все обозначения соответствуют принятым на конференции по гриппу, проходившей в 1971 г. в Мадисоне (США)  (Kilbourne et al., 1972).

2. Полипептиды Р

Функции и точная локализация в вирионе самых больших белков с относительной молекулярной массой 81000—94 000, обозначаемых как Pi и Р2, до настоящего времени не установлены. Известно, однако, что эти белки являются внутренними компонентами вириона; они, по всей вероятности, ассоциированы с нуклеокапсидом и могут осуществлять РНК-транскриптазную активность вириона (Compans et al., 1970a; Schulze, 1970; Skehel, 1971; Klenk et al., 1972a; Bishop et al., 1972; Caliguiri, Compans, 1974).

3. Гемагглютинин

Самый большой гликопротеид — гемагглютинин, обозначаемый символом НА, с относительной молекулярной массой 75 000—80 000, является белком, осуществляющим адсорбцию вирионов на клеточных рецепторах. Он синтезируется как отдельный первичный продукт одного гена, но при определенных условиях может протеолитически расщепляться с образованием двух полипептидов: HAi и НА2 — с относительной молекулярной массой около 50 000 и 28 000 соответственно (Lazarowitz et al., 1971). Такое расщепление, степень которого может .варьировать в широких пределах, зависит от типа клетки-хозяина, штамма вируса и наличия или отсутствия плазминогена либо других протеолитических фер1ментов в среде культуры клеток или другой хозяйской системы, такой, например, как аллантоисная жидкость куриного эмбриона (Lazarowitz et al., 1971, 1973а, b; Rifkin et al., 1972; Klenk et al., 1972b; Skehel, 1972; Stanley et al., 1973). В куриных эмбрионах обычно происходит полное расщепление (Lazarowitz et al., 1973), что обусловило обнаружение двух полипептидов гемагглютинина в ранних работах (Laver, 1971; Stanley, Haslam, 1971), обычно называемых тяжелой и легкой цепью гемагглютинина и обозначаемых символами HAi и НА2. Эти две компоненты НА-белка удерживаются рядом друг с другом за счет существования между иими дисуль-фидных -мостиков (Laver, 1971). Расщепление молекулы НА не является необходимым условием сборки вирусной частицы или наличия у нее гем'агглютинирующей активности (Lazarowitz et al., 1963a; Stanley et al., 1973) и при некоторых условиях вирионы формируются вообще без расщепления молекул НА (Lazarowitz et al., 1973a, b; Choppin et al., 1975),. что указывает на несущественную роль этого этапа в процессе сборки. На 2 представлен электрофоретический профиль белков вируса гриппа штамма WSN, где расщепление полипептида НА не происходит при отсутствии сывороточного плазминогена, но имеет место в случае, когда этот фермент имеется в среде. Недавно было показано, что инфекци-онность вирионов гриппа (как типа А, так и типа В), в которых первоначально не было обнаружено расщепление молекул НА, может быть увеличена при расщеплении этих молекул с помощью трипсина (Choppin, Lazorowitz, неопубликованные данные; Klenk и Rott, персональное сообщение). Детальный механизм подобного роста инфекционности в настоящее время еще не установлен, однако при выяснении em должны быть, вероятно, учтены ранние этапы взаимодействия вируса с клеткой, не связанные с адсорбцией.

Как будет детально обсуждено в гл. 3, 10 и 12, гемагглютинин и нейраминидаза, выделенные из различных штаммов

вируса гриппа, сильно отличаются по последовательности аминокислот и антигенным свойствам. Эти поверхностные гликопротеиды ответственны за штаммовую специфичность вирионов гриппа.

4. Нейраминидаза

Полипептид нейраминидазы (NA) является гликопротеид ом, субъединицы которого имеют относительную молекулярную массу в пределах от 5000 до 65000. Величина относительной молекулярной м'ассы NA зависит как от штамма вируса, так и от условий выделения, принятых в различных лабораториях (Haslam et al., 1970b; Webster, 1970; Skehel, Schild, 1971; Gregoriades, 1972; Lazdins et al., 1972). Были обнаружены два различных вида полипептидов NA при ее изоляции из одного типа  вирионов   (Webster,   1970;  Skehel,

Schild,  1971; Bucher, Kilbourne,  1972; Lazdins et al.,  1972). Lazdins и соавт.   (1972)  обнаружили мажорную компоненту с относительной молекулярной массой 63 000 и минорный полипептид в 56 000, однако при обработке препарата вируса трипсином они обнаружили только одну компоненту с низкой молекулярной массой. Это указывает на то, что меньший по молекулярной  массе лолипептид 'был получен  из   большего с   помощью   протеолитического   расщепления.   Меньший   по размерам полипептид не агрегировал. Это означает, что при протеолитической   обработке   отщепляется   гидрофобная   область молекулы. Электронно-микроскопическое исследование Wrigley и соавт. (1973) показало, что лри обработке трипсином   удаляется   «ножка»   грибообразного   нейраминидазного «шипа».  Сохранение ферментативной активности при такой обработке указывает на то, что активный центр фермента находится на гантелеобразной «головке» «шипа» нейраминида-зы. Как будет подробно изложено в гл. 3, имеется много доказательств того, что фермент присутствует в вирионе в форме тетрамера с относительной молекулярной массой 200 000— 250 000  (Kendal, Eckert,  1972;  Bucher,  Kilbourne,   1972;  Lazdins et al., 1972; Wrigley et al., 1973).

5.         Белок нуклеокапсида

Полипептид, обозначаемый символом NP, 'представляет собой белковые субъединицы нуклеокалсида (Duesberg, 1969; Joss et al., 1969; Pons et al., 1969). Оценки относительной молекулярной массы, проведенные во многих лабораториях для белка NP раеличных штаммов вируса гриппа, дали величины от 55 000 до 65 000. Величина 60 000 обычно принимается за среднюю относительную молекулярную массу этого белка. Он не содержит углеводов и является типоспецифическим антигенам, на свойствах которого основана классификация вируса гриппа на типы А, В и С (см. .гл. 12). Аминокислотный анализ белка NP, выделенного из штамма вируса гриппа типов А и типа В, дал существенно различные результаты (Laver, Baker, 1972). Белок NP обладает аффинным сродством как к вирио'нной РНК, так и к комплементарным к ней цепям (Scholtissek, Becht, 1971).

7. Количество полипептидов в вирионе

В связи с тем что вирионы гриппа гетерогенны по своим размерам, а также в связи со штаммовой вариабельностью очень трудно точно определить число молекул различных полипептидов, входящих в состав отдельной вирусной частицы. Кроме того, число молекул полипептида НА, а также продуктов их расщепления — полипептидов HAi и НАг — может существенно зависеть от степени расщепления НА, которая, как было описано ранее, в свою очередь зависит от многих условий. И, наконец, общее число молекул гликопротеидов НА и NA в вирионе одного штамма вируса может меняться в зависимости    от типа    клетки-лозяина    (Lazarowitzetal., 1973а; Choppin et al., 1975). Таким образом, любой расчет числа полипептидов в вирионе гриппа можно считать лишь приблизительным и справедливым только для усредненного вириона при определенном наборе условий. В табл. 7 приведены предельные значения для числа лолипептидов в вирионе, полученных в различных лабораториях с довольно хорошим совпадением результатов. Для более детальной информации о значениях, «полученных разными авторами, изучавшими различные штаммы вирусов, читатель может обратиться к подробному обзору White (1974), где сведены данные о белках вируса гриппа.

8. Вирусы гриппа В и С

Исследование химического состава и структуры вирионов, а также содержащихся в них белков было выполнено в основном на штаммах вирусов гриппа А. В некоторых работах, однако, в качестве объекта изучения использовали штамм Lee вируса гриппа В. В основном была показана идентичность химического состава и структуры вирусов гриппа Аи В (Haslam et al., 1970b; Lazdins et al., 1972; Laver, Baker, 1972; Oxford, 1973; Tobita, Kilbourne, 1975). Однако некоторые небольшие, но существенные различия -были найдены для  штамма  GL/1760/54  вируса  гриппа   В   (Choppin   et  al., 1975). Этот вирус, выращенный на клетках почки хомячка,, не имел белка Р, а сравнение злектрофоретического профиля белков вируса этого штамма и штамма WSN вируса гриппа А показало, что белки НА, NP и NA штамма GL/1760 имеют несколько большую молекулярную массу  (относительная молекулярная масса была равна соответственно 82 000, 66 000 и 64 000), в то время, как М-белок штамма GL/1760 (молекулярная масса — 24 000)  был несколько меньше, чем М-'белок штамма WSN.  На   3  представлен электрофоретичеокий профиль в полиакрила'мидном геле белков штамма B/GL/1760. Удивительным     фактом,     обнаруженным   для    штамма GL/1760,  который  выращивали  на клетках  почий  хомячка, было полное отсутствие расщепления белка НА. Тем «е менее можно было провести расщепление полипептида НА на фрагменты HAi и НА2 в системе in vitro. Было, кроме того, показано, что полипептиды NA и HAi содержат остатки фу-козы,  а  НА2  их  не содержит и  в  его  состав входит глю-козамин. Таиим образом, в этом случае в области НА2 гемаг-ГЛЮТИНИНОВО1ГО «шипа» 'наблюдается    отсутствие    сахарного остатка, обычно локализованного на .концах сахарных цепо-

чек. С помощью этой области, как известно, «шип» гемаг-глютинина присоединяется к вирусной мембране. Отсутствие фукозы в составе полипептида НА2 и наличие ее в составе HAi и >NA этого штамма, а также в составе полипептида НА2 других штаммов указывает на возможное наличие более тесного взаимодействия полилептида НА2 штамма GL/1760 с вирусной мембраной и на то, что это взаимодействие может оказать влияние на процесс гликозидирования, заканчивающийся на поверхности мембраны.

Другим интересным наблюдением, сделанным при анализе экспериментов по /позднему и раннему включению радиоактивных аминокислот в вирион гриппа штамма GL/1760, явилось  то,  что мембранный  белок синтезировался  в  процессе репродукции относительно поздно, а белок NP, синтезирующийся на ранних этапах инфекционного цикла, инкорпориро-•   вался в вирионы, уже содержащие 'белок М, который синтезируется позднее. Этот результат был получен  с помощью метода включения в  белки радиоактивных аминокислот на ранних и поздних этапах репродукции (Choppin et al., 1975). Сходные данные были недавно получены для штамм-а WSN (Meier-Ewert, Compans,  1974).  Эти результаты согласуются с высказанным ранее утверждением,    что синтез    М-белка жестко детерминируется и может являться этапом, на 'котором контролируется скорость вирусной репродукции (Lazaro-witz et al., 1971).

Относительно мало работ было выполнено с использованием в качестве объекта изучения вируса гриппа С. Выполненное недавно предварительное исследование показало в основном сходность его химического состава с составом вирусов гриппа А и В. Однако следует отметить, что вирус гриппа С не обладал нейраминидазной активностью. Это указывает на то, что этот вирус может содержать в своем составе гликозидазу другого типа, способную разрушать вирусные рецепторы (Kendal, Kiley, 1974).

г. липиды

Липиды, содержащиеся в вирионе гриппа, локализованы в вирусной мембране и, как будет описано далее, существуют в виде двойного липидного слоя. Из 20—24% массы ви-риона, приходящихся на липиды, основную часть составляют фоефолипиды (ГО—'13%) и холестерин (6—8%), а также малый по количеству, но, вероятно, важный компонент — глико-липиды (1—2%) (Frommhagen et al., 1959; Kates et al., 1961; Blough, Merilie, 1970; Klenk et al., 1972a; Klenk, Choppin, неопубликованные данные). Проведенные ранее исследования показали, что предварительно меченные клеточные липиды включаются в вирионы гриппа (Wecker, 1957) и что липидный состав вирионов, культивированных на различных клетках, сходен с .липидным составом этих клеток (Kates et al.,'1961)1. Было обнаружено, что .клетка-хозяин играет определяющую роль в формировании .липидов вируса. Позднее Blough и соавт. проанализировали липидный состав вирусов-гриппа различных штаммов, выращенных на куриных эмбрионах (Tiffany, Blough, 1969; Blough, 1971; Blough, Tiffany, 1973). На основании различий в липидном составе этих вирусов авторы предположили, что состав липидов вируса определяют белки вирусной оболочки за счет селективного' взаимодействия между молекулами белков и липидов. Однако наблюдаемые различия касались в основном жирных кислот нейтральных липидов. В связи с тем что этот компонент составляет лишь небольшую часть от общего липидного' содержания вируса и поскольку жирные кислоты полярных липидов, входящие в состав различных штаммов вируса гриппа, в основном сходны, значение указанных выше различий пока еще неясны. Анализ липидного состава был проведен для вирионов, выращенных на куриных эмбрионах в условиях множественного цикла репродукции; штаммы могли различаться по кинетике роста вирусной популяции и по степени влияния на клеточный метаболизм. В связи с этим мог меняться липидный состав мембран хозяйских клеток. Кроме того, анализ липидного состава проводили на вирионах, выращенных в разное время на различных партиях эмбрионов,, что также трудно учесть при интерпретации полученных результатов.

Анализ липидного состава вирионов гриппа при их культивировании в более контролируемых условиях клеточных культур имеет очевидные преимущества. Было проведено' детальное сравнение липидного состава оболочечных вирусов и плазменных мембран различных клеток, на которых эти вирусы (культивировались. Анализировали включение в мембраны фосфолшгадов, холестерина, гликолипидов и жирных кислот (Klenk, Choppin, 1969, 1970а, b; Choppin et al., 1971; Renkonen et al., 1971; Quigley et al., 1971; Laine et al., 1972; McSharry, Wagner, 1971). Хотя в некоторых случаях и наблюдались незначительные различия, липидный состав вирусов был очень сходен с липидным составом плазматических мембран хозяйских клеток. Концентрация фосфолипидов в данном вирусном штамме может отличаться по крайней мере в 3 раза в зависимости от типа клетки-хозяина. На-

блюдались также качественные различия в составе гликолипидов (Klenk, Choppin, 1969, 1970b). Кроме того, было показано, что содержание жирных кислот может меняться в 4 раза в зависимости от среды культивирования (Klenk, Choppin, 1970b). Приведенные результаты указывают на то, что, хотя при определенных условиях и могут наблюдаться незначительные вариации в липидном составе вируса гриппа, за которые могут быть ответственны вирусные белки, определяющее влияние на липидную композицию мембраны оказывает клетка-хозяин и что липидный состав вируса повторяет липидный состав плазматических мембран хозяйских клеток.

Однако наблюдаемое сходство лилидного состава вирусных и клеточных мембран и утверждение об определяющем влиянии клетки-хозяина на состав липидов вириона совсем не означают, что все липиды, включающиеся в дальнейшем в вирусную частицу, присутствуют в клетке к началу инфекционного процесса. Действительно, тот факт, что для многих оболочечных вирусов вирусная репродукция продолжается в течение длительного периода, указывает на то, что некоторые вновь синтезированные молекулы липидов инкорпорируются в вирионы. Однако сообщение Blough (1974) о том, что вновь синтезированные липиды включаются в состав вириона, совсем неэквивалентно утверждению, что синтез этих липидов определяется вирусом. Это означает только, что биосинтез липидов, которые [впоследствии войдут в состав вирусной мембраны, не прекращается после начала инфекции и что при оборке вирусной частицы используются как вновь синтезирующиеся, так и уже предсуществующие в клетке молекулы липидов.

Основное качественное различие между липидами вируса и клетки-хозяина состоит в том, что в вирионах гриппа не обнаруживается гликолипидов, содержащих нейраминовую кислоту (ганглеозиды); нейраминовой кислоты нет также в составе вирусных гликопротеидов (Klenk, Choppin, 1970b; Klenk et al., 1970b). Отсутствие остатков нейраминовой кислоты в вирионе объясняется включением вирусного фермента нейраминидазы в те области мембраны, которые впоследствии сформируют вирусную оболочку. Оболочечные вирусы, не содержащие нейраминидазу, такие, например, как вирус везикулярного стоматита, содержат в мембране ганглеозиды, сходные с ганглеозидами клеточных мембран (Klenk, Choppin, 1971).

Липиды, входящие в состав мембран вирусов гриппа и других оболочечных вирусов, явились предметом вышедших недавно обзоров '(Choppin et al., 1971; Blough, Tiffany, 1973; Klenk, 1973, 1974; Lenard, Compans, 1974; Choppin, Compans, 1975; Сотргпэ, Choppin, 1975).

Д. УГЛЕВОДЫ

Кроме рибозы, входящей в состав вирусной РНК, приблизительно 5—8% массы вириона гриппа составляют углеводы (Frommhagen et al., 1959). Большая часть, если не все углеводы вириона, ковалентно присоединена к молекулам гликопротеидов или гликолипидов. В вирионе гриппа присутствуют галактоза, манноза, глюкоза-мин и фукоза, а состав Сахаров эквивалентен составу углеводного компонента мукопротеидов клетки-хозяина (Ada, Gottschalk, 1956). Изолированный HAi-гликопротеид гемагглютинина вируса гриппа штамма BEL, который предварительно (культивировали на куриных эмбрионах, содержал 9,4% N-ацетилглюкозамина и около 20% его общей массы составляли углеводы (Laver, 1971, 1973). Углеводы являются именно тем хозяйским антигеном, который был найден в составе очищенных вириояов (Knight, 1946; Smith et al., 1953) в ковалентно связанном с вирусным гликопротеидом виде (НагЬое, 1963; Laver, Webster, 1966; Lee et al., 1969). Из мембран инфицированных клеток (Laver, Webster, 1966) и из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов (Haukenes et al., 1965; Lee et al., 1969) был выделен углеводный компонент, который обладал антигенным родством с хозяйским антигеном очищенных вирионов. Антиген, выделенный из аллантоисной жидкости, являлся муко-полисахаридсульфатом, не содержащим уроновой или нейраминовой кислоты, и по своему составу принадлежал к классу кератосульфатов (Haukenes et al., 1965). Недавно было показано, что гликопротеиды вириона гриппа селективно метятся радиоактивным сульфатом, связывающимся, вероятно, с углеводной частью в виде эфира (Compans, Pinter, 1975). Кроме того, 'было обнаружено, что сульфат включается в компонент с большой относительной молекулярной массой, являющийся, вероятно, мукополисахаридом хозяйской клетки, который может быть тождествен хозяйскому клеточному антигену, ассоциированному с очищенным вирионом.

Включение радиоактивных предшественников глюкозами-на и фукозы в вирусные гликопротеиды НА и NA указывает на то, что углеводная часть этих молекул синтезируется уже после начала вирусной инфекции (Compans et al., 1970a; Schulze, 1970). Синтезируются ли вновь или используются существовавшие ранее углеводы для построения вирусных гликолипидов — вопрос, который еще требует разрешения.

49

Существующие ;в настоящее время факты указывают на то, что последовательность и состав углеводных остатков в вирусных гликопротеидах и гликолипидах определяются клеткой-хозяином. В дополнение к указанным «хозяйским» антигенным свойствам углеводного компонента различие в электрофоретической подвижности гликопротеидов  вирионов

гриппа, выращенных на различных клеточных культурах, указывает на то, что какое-то количество сахарных остатков, включенных в молекулы гликопротеидов, может иметь клеточное происхождение (Haslam et al., 1970a; Compans et al., 1970a; Schulze, 1970). Для синтеза углеводных цепочек гликопротеидов необходимо по крайней мере четыре типа специфических трансфераз и, вероятно, сама вирусная частица не содержит достаточного количества генетической информации для кодирования синтеза этих ферментов. Гликозидирование полипептида НА, вероятно, происходит на мембранах эндо-плазматического ретикулума по механизму, сходному с механизмом синтеза углеводов 'Клеточных гликопротеидов (Compans, 1973b; Hay, 1974).

Остатки нейраминовой кислоты не содержатся в вирионах гриппа, вероятно, потому, что в них присутствует нейрамини-даза (Klenk, Choppin, 1970; Klenk et al., 1970a, b; Palese, et al., 1974). Вирионы парагриппа, в состав (Которых также входят нейраминидаза, не содержат в тликопротеидах и глико-липидах остатков нейраминовой кислоты (Klenk, Choppin, 1970b; Klenk et al., 1970a, b). В то же время в состав оболо-чечных вирусов других типов, не 'содержащих нейраминида-зы, входят остатки нейраминовой кислоты. Нейраминидаза, вероятно, необходима тем оболочечным вирусам, которые прикрепляются к рецепторам, содержащим нейраминовую кислоту. Этот вопрос будет подробнее освещен в гл. 3. В «летках, зараженных температурочувствительным мутантом, лишенным нейраминидазы, синтезируются вирусные частицы, содержащие остатки нейраминовой кислоты и образующие большие по размерам агрегаты на поверхности клетки (Palese et al., 1974). Процесс агрегации может быть подавлен добавлением нейраминидазы. Эти факты указывают на то, что нейраминовая кислота, содержащаяся в составе ви-риона, может служить рецептором для гемагглютининов других вирусных частиц, а это должно способствовать агрегации и низкому выходу инфекционных частиц. Таким образом, отсутствие остатков нейраминовой кислоты в вирионах гриппа и парагриппа является вирусспецифической модификацией вирусных углеводов; этот .процесс необходим для нормального  высвобождения  вируса  из  инфицированной «летки.

В присутствии модифицированного метаболита 2-дезо,кси-D-глюкозы или высоких концентраций глюкозамина интиби-руется процесс гликозидирования вирусных гликопротеидов и в инфицированных клетках обнаруживается негликозиди-рованный или гликозидированный частично полипептид — предшественник НА (Klenk et al., 1972b; Gandhi et al., 1972). Дефектные гликопротеиды, синтезируемые в присутствии указанных выше ингибиторов, обнаруживаются на гладких и грубых мембранах эндоплазматического ретикулума и включаются в состав вновь синтезируемых вирусных частиц (Klenk et al., 1974; Compans et al., 1974). Эти вирусные частицы обладали пониженной инфекционностью и гемагглюти-нирующей активностью. Таким образом, наличие нормального углеводного компонента, вероятно, не является необходимым условием ассоциации гликопротеидов с цитоплазматиче-скими мембранами. Однако, поскольку в этом случае имеет место снижение выхода зрелых вирионов, можно заключить, что процесс гликозидирования, вероятно, необходим для реализации полной 'биологической активности 'вириона.

Hi. МОРФОЛОГИЯ И ВЗАИМОСВЯЗЬ

КОМПОНЕНТОВ В ВИРИОНЕ

А. РАЗМЕР И ФОРМА

' Ранние исследования вируса гриппа с помощью методов ультрафильтрации и электронной микроскопии показали, что лирионы гриппа имеют форму, близкую к сферической, со средним диаметром 80—120 нм (Elford et al., 1936; Taylor et al., 1943). С помощью негативного контрастирования вирионов гриппа было обнаружено, что поверхность вирусных частиц покрыта близко расположенными друг к другу выступами, ворсинками длиной 10—12 нм и что нуклеокапсид, заключенный внутри вирусной оболочки, имеет спиральную симметрию (Home et al., 1960; Hoyle et al., 1961). Метод негативного контрастирования позволил, кроме того, обнаружить гетерогенность и плеоморфизм популяции вирионов гриппа. Плеоморфизм, однако, обусловлен в основном методом выделения и очистки и может (быть сведен к минимуму с помощью фиксации вирионов перед контрастированием (Choppin et al., 1961). На 4 и 5 показаны вирионы гриппа после их негативного контрастирования.

Хотя большинство лабораторных штаммов вируса гриппа имеет форму вирионов, близкую к сферической, оттененные напылением препараты штамма Япония/305 вируса гриппа А имели слегка вытянутую, бактериоподобную форму ппрусных частиц (Choppin et al., 1960), а при наблюдении с помощью метода ультратонких срезов вновь образующихся пприонов гриппа было показано, что они имеют слегка вытянутую форму (6) (Compans, Dimmock, 1969; Bachi et al., 1969; Compans et al., 1970b). Нуклеокапсид вирусных частиц г, ультратонком срезе выглядит как нити с более высокой электронной плотностью, ориентированные параллельно длинной оси частицы, а оболочка представляет собой мембрану го слоем выступов на внешней поверхности  (см. 5—8).

Кроме обычно наблюдаемых частиц, форма которых близка к сферической или слегка вытянутой, в препаратах вируса гриппа иногда обнаруживаются филаментозные  формы.  Фи-

ламентозные вирионы покрыты поверхностными выступами и имеют диаметр, характерный для сферических вирионов, т. е. 80—100 нм, що их длина может быть очень велика — 4 мкм (Mosely, Wickoff, 1946; Chu et al., 1949; Choppin et al., 1960, 1961). На 5 показан филаментозный вирион гриппа при его негативном контрастировании. Наличие филаментоз-ных форм характерно для вновь выделенных штаммов (Chu et al., 1949; Choppin et al., 1960). Возможно, что филамен-тозные формы также преобладают при инфекциях верхних дыхательных путей человека, поскольку при первом пассаже на  куриных эмбрионах вирусная популяция содержит большое число филаментов, в то время как -после нескольких пассажей в популяции обнаруживаются преимущественно сферические частицы (Choppin et al., 1960). Маловероятно, что первый пассаж на куриных эмбрионах приводит к селекции филаментозяых частиц из преимущественно сферической популяции вирусов пр-и инфекции у человека, а затем, при -последующих пассажах на куриных эмбрионах, вновь отбираются сферические формы. Однако природа морфологии вирионов, продуцируемых при заболеваниях человека, будет установлена лишь после исследования достаточно большого числа вирусных популяций, выделенных 'непосредственно у человека. Была определена удельная инфекцнонность фила-ментозных форм. Она оказалась выше, чем удельная ин-фекци-онность сферических вирусных частиц. Филаментозные вирионы содержали больше РНК в расчете на один вирион, чем сферические (Ada et al., 1958).

Способность IK репродукции фяламентозных форм является генетическим признаком, который может быть утрачен или приобретен в процессе -рекомбинации (Kilbourne, Murphy, 1960; Kilbourne, 1963; Choppin, 1963). Рекомбинация между штаммами АО, для которых характерны сферические частицы, с филаментозными штаммами А2 приводила к возникновению сферических частиц с признаками штам>ма А2 и вирионов высокофиламентозного штамма АО. Таким образом, признак филаментозности может использоваться в качестве маркера в генетических исследованиях. Также генетически обусловленные вариации морфологии вирионов указывают на различие в структурной организации или в скорости синтеза белков вирусной оболочки, вероятно М-белка. Предварительные исследования сферических и филаментоз-ных форм одного и того же штамма не выявили различий в суммарном белковом составе (Choppin, неопубликованные данные), однако для полного выяснения этого вопроса требуется более детальное -изучение.

Было показано, что поверхностно-активные вещества, такие, как алкоголят витамина А, индуцируют образование ф.и-ламентозных и высокоплеоморфных частиц в штаммах, для которых в обычных условиях характерна продукция сфериче-

ских частиц (Blough, 1963). Хотя эти наблюдения и указыва- ! ют на то, что форма вирионов может зависеть от присутствия '' такого рода соединений, они не противоречат данным, кото- ': рые интерпретируются с учетом генетического контроля за ' образованием филаментозных форм при отсутствии поверхностно-активных веществ.

При исследовании вирионов гриппа с помощью методики : лиофильного высушивания и методики «фриз-эйтчинг» (Ner- ; mut, Frank, 1971) наблюдали высокую степень однородности популяции вирионов. Некоторые из частиц давали тени, ха- : рактерные для правильных многогранников, и на этом основании был сделан вывод, что вирионы гриппа могут иметь икосаэдрическую симметрию. Наблюдались также упорядоченные гексагональные образования на поверхности вирионов (Almeida, Waterson, 1957; Archetti et al., 1967; Nermut, Frank, 1971), а в случае вирионов гриппа С была обнаружена гексагональная решетка, выстилающая внутреннюю сторону поверхности вириона (Waterson et al., 1963; Flewett, Apostolov, 1967). Было предположено, что М-белок вируса гриппа образует икосаэдрическую оболочку под двойным ли-пидным слоем и таким образом выступает в качестве своего рода капсида вируса (Schulze, 1973). Однако более поздние эксперименты не подтвердили наличия у вирионов икосаэдри-ческой симметрии, и, действительно, имеются веские причины в пользу того, что такая симметрия для внрионов гриппа маловероятна. Хотя и имеются другие примеры вирионов с икосаэдрической симметрией, которые могут существовать либо в виде длинных трубчатых структур, либо в виде икосаэдров, сферические вирионы гриппа имеют размеры, лежа-щие в широких пределах, а до сих пор нет прецедента, когда идентичные субъединицы образовали бы икосаэдрические календы с непрерывным набором размеров. Большинство наблюдаемых вирионов не имеет контуров, характерных для икосаэдрической симметрии, а наблюдаемые иногда угловатые очертания могут быть результатом деформации. Таким образом, для убедительного доказательства наличия у вирусной оболочки икосаэдрической симметрии требуются дополнительные аргументы.

Б. ПОВЕРХНОСТНЫЕ «ШИПЫ»

Поскольку вопросу о строении гемагглютинина и нейр-аминидазы будут посвящены гл. 3 и 10, здесь мы коротко коснемся этой проблемы.

1. Гемагглютинин

Как уже было указано, поверхностный «шип» гемагглютинина формируется из субъединиц гликопротеида с молекулярной массой приблизительно 75 000—80 000.  Гликопротеид

может находиться либо в виде одной полипептидной цепи II А, либо в 'виде комплекса продуктов ее протеолитического> расщепления — HAi и НА2, которые продолжают удержи-и.чться рядом друг с другом за счет наличия между ними дисульфидиых мостиков.

В исследованиях с использованием для разрушения ви-Iпионов эфира было показано, что из вируса может быть изолирован компонент, обладающий гемагглютинирующей активностью (Hoyle, 1952; Scharer, Zillig, 1954) и что при негативном контрастировании субъединиц гемагглютинина наблюдаются резеткоподобные структуры диаметром 30— 1Ю им, в которых частицы, идентичные присутствующим на поверхности вириона, располагаются радиально (Hoyle et al., 1961; Choppin, Stoeckenius, 1964). Laver и Valentine (1969) изолировали поверхностные «шипы», используя штамм, в котором гемагглютинин был устойчив к обработке додецилсуль-фатом натрия (SDS). Эти структуры имели диаметр около 4 ям и длину 14 нм. После удаления SDS структуры агрегировали идентичными концами, что указывает на гидрофобный характер этих областей поверхностных «шипов». Основываясь на размерах «шипов» гемагглютинина, определенных по электронно-микроскопическим снимкам, Laver и Valentine (1969) установили, что их молекулярная масса должна быть не менее 150 000. После того как стало ясно, что поверхностные «шипы» формируются из белковых молекул с молекулярной массой 75 000—80 000, было предположено, что две такие белковые молекулы (представляющие собой комплекс HAi и НА2) образуют «шип» гемагглютинина (Laver, 1971; Stanley, Haslam, 1971; Skehel, Schild, 1971). Позднее с помощью седиментационных методов (Brand, Skehel, 1972) было выяснено, что молекулярная масса «шипов» гемагглютинина равна 215 000, а их изучение с помощью метода электронной микроскопии показало, что они имеют треугольную форму, если смотреть в торец выступа (Laver, 1973; Griffith, 1975). В связи с этим был сделан вывод, что каждый «шип» гемагглютинина является тримером, состоящим из трех НА-полипептидов, каждый из которых является комплексом HAi + + НА2.

Гидрофобное свойство основания «шипа» гемагглютинина указывает на то, что именно эта область определяет его связь с вирусной мембраной (Laver, Valentine, 1969). Впоследствие было показано, что после обработки протеазой можно получить вирусные частицы, сохраняющие в своем составе полипептид НА2, но не обладающие гемагглютинирующей активностью и не содержащие различимых поверхностных «шипов» (Compans et al., 1970а). Это доказывает, что именно НА2— часть молекулы НА —отвечает за связь «шипа» с поверхностью вириона.  Это согласуется с выводом  Brand  и Skehel (1972) о том, что «шипы» гемагглютинина могут быть солю-билизированы с помощью протеазы и при этом они теряют только небольшую часть лолипептида НА2. Такие частицы неспособны ж агрегации и могут быть кристаллизованы. Таким образом, приведенные факты ясно показали, что НА2 — часть гликопротеида НА —содержит гидрофобную область и отвечает за связь «шипа» гемагглютинина с мембраной. Детали механизма взаимодействия «шипа» с вирусной мембраной еще не совсем ясны. Однако уже сейчас можно утверждать, что, как будет подробно обсуждено далее, липиды вирусной мембраны сгруппированы в двойной слой и лишь небольшая часть «шипа» гемагглютинина проникает в этот слой. Именно поэтому небольшой по молекулярной массе пептид, содержащий большое число гидрофобных аминокислотных остатков, вероятно, остается в составе вирусной частицы после ее обработки протеазой (Compans, неопублико-занные данные). Протеаза лишь незначительно изменяет структуру липидного двойного слоя и, вероятно, эта структура стабилизируется в большей степени липид-липидным взаимодействием, чем связью между глшдапротеидными и ляпид-ными молекулами (Compans et al., 1970a; Landsberger et al 1971, 1973).

2. Нейраминидаза

В работе, в которой из различных штаммов вируса гриппа изолировали поверхностные «шипы» гемагглютинина (La-ver, Valentine, 1969), кроме того, выделяли структуры отличной морфологии, обладающие нейраминидазной активностью. Это наблюдение подтвердило мнение о том, что на поверхности вирионов гриппа имеются два различных типа «шипов». «Шипы» нейраминидазы имели продолговатую головку размером приблизительно 5x8,5 нм, присоединенную к нитевидной ножке длиной около 10 нм, на конце которой имелось небольшое утолщение диаметром 4 нм. В отсутствие детергента эти структуры слипались своими концами, образуя розетки. Следовательно, в их составе также имеются гидрофобные области. Хотя из вирионов с помощью детергентов и изолировали два различных типа поверхностных структур, их не удалось до настоящего времени различить на поверхности необработанных вирусных частиц, что, вероятно, объясняется их близким расположением в вирусной оболочке. Это может быть также обусловлено трудностью идентификации «шипов» нейраминидазы на фоне большого числа поверхностных структур гемагглютинина.

Как было уже оказано, молекулярная масса мономерной субъединицы NA лежит в пределах 55000—65 000. Имеются биохимические и морфологические аргументы в пользу того,

что нейраминидазный «шип» представляет сооои тетрамер с молекулярной массой 200 000—250 000 (Kandal, Eckert,. 1972; Bucher, Kilbourne, 1972; Lazdins et al., 1972; Wrigley i'.t al.. 1973). Электронно-микроскопические .исследования нейраминидазы после ее обработки трипсином выявили структуры, состоящие из четырех сфер диаметром 4 нм, сгруппированных в квадратную компланарную структуру (Wrigley et al., 1973). Такого рода тетрамер на виде сбоку соответствует вытянутой головке нейраминидазного «шипа»,, изолированного с помощью детергента. С помощью обработки трипсином разрушалась стеблеобразная нить субъединицы нейраминидазы.

Так же как в случае гемагглютинина, механизм присоединения нейраминидазы к вирусной мембране не совсем ясен. Вероятно, подобно «шипу» гемагглютинина, «шип» нейраминидазы имеет гидрофобную область, которая вовлечена в это взаимодействие и при определенных условиях подвержена действию протеазы.

В. ДВОЙНОЙ ЛИПИДНЫЙ СЛОЙ

В связи с тем что вирионы гриппа образуются в процессе отпочкования от плазменных мембран, причем вирусные частицы получают свои липиды именно от этих клеточных ор-ганелл, вполне вероятно, что организация липидов в вирусной оболочке зеркально отображает организацию липидного слоя плазменных мембран клетки. Имеющиеся в настоящее время данные указывают на то, что -вирусные липиды организованы в структуру, представляющую собой двойной ли-пидный слой. Исследования, проведенные с помощью метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) при использовании спин-меченных производных стеариновых кислот, показали, что в вирионах гриппа имеется именно двухслойная структура липидов (Landsberger et al., 1971, 1973). Градиент подвижности спиновых зондов, характерный для структур тина двойного слоя (McConnell, McFarland, 1972), наблюдался также и в случае спин-меченных вирионов гриппа. Если 'спиновый зонд, содержащий нитроксидное ядро, был прикреплен близко к полярному концу молекулы стеариновой кислоты, он находился в вирионе в области с относительно высокой степенью упорядоченности липидного слоя. Если же эта группа находилась относительно далеко от .карбоксильного конца молекулы стеариновой кислоты, то ее окружение более приближалось к жидкофазному состоянию. На 9 приведены спектры ЭПР вирионов гриппа с включенными в них спин-меченными стеариновыми кислотами и спектры эритроцитов человека, полученные в аналогичных условиях; в случае обеих мембран спектры очень сходны.

На основании экспериментов, проведенных с соединением, которым метили поверхностные структуры, был сделан вывод, что структура фосфолипидов поверхностных мембран -клетки асимметрична, причем холинсодержащие молекулы в основ-н:>м сосредоточены во внешней части двойного слоя, в то вре-VR как аминофосфолипиды расположены в его внутренней части (Bretscher, 1972, 1973). Свойствен ли такой тип структуры вирусной оболочке, пока не ясно, однако существующие г настоящее время данные об организации липидной оболоч-УМ ларагриппозных вирусов (Klenk, Choppin, 1969, 1970а) не согласуются с утверждением о том, что фосфатидилэтанол-iMira и фосфатидилсерин всегда расположены на внутренней части двойного липидного слоя, а фосфатидилхолин — на его внешней части. Отношение количества аэдинофосфолипидов к количеству холинсодержащих фосфолипидов варьирует в ши-z эких пределах для вирусов, выращенных на «летках различных типов, и это отношение коррелирует с аналогичной величиной для клеток-хозяев. В связи с тем, что все исследованные вирусы парагриппа содержали в 'поверхностном слое одинаковые белки, утверждение о возможном вытеснении ли-пидов из части 'биелоя за счет внедрения туда белковых молекул (Bretscher, 1973), не согласуется с наличием различий з фосфолипидном составе. В связи с этим возможно, что разное соотношение липидов отражает различное распределение индивидуальных фосфолипидных молекул во внутренней и внешней частях двойного липидного слоя.

В ультратонких срезах вирион гриппа имеет характерную мембранную структуру, морфологически сходную со структу-эой поверхностной клеточной мембраны «летки-хозяина (см. 6—8). Внешний вид вирусной оболочки зависит как от вида клеток, на которых вирус выращивали, так и от вида электронно-микроскопического контрастирования (Compans, Dimmock, 1969). Если на поверхности клетки удается обнаружить элементарную мембрану, в вирусной частице наблюдается мембрана аналогичного вида. Внешний слой вирусной мембраны покрыт поверхностными «шипами», а на внутренней поверхности был обнаружен дополнительный слой с высокой электронной плотностью, который не обнаруживается в нормальной клеточной мембране. Как будет показано далее, вполне вероятно, что этот слой соответствует локализации на внутренней поверхности двойного липидного слоя молекул М-белка.

Распределение контрастного вещества после фиксации мембран осмием, вероятно, отражает локализацию амннофос-фолипидов (Bretscher, 1973). При фиксации и контрастировании осмием отчетливо окрашиваются как внутренний, так и внешний слои листка элементарной мем-браны клеток MDBK, в то время как в клетках BHK21-F или клетках куриных фибробластов окрашивается только цитоплазматический слой. Окраска внешнего слоя вирионов гриппа, выращенных на «летках MDBK, коррелирует с более высоким содержанием аминофоофолипидов в этих клетках (Klenk, Choppin, 1970а) и возможно, что в этих условиях аминофосф'Олипиды распределены на обеих сторонах двойного слоя, в то время ка,к они отсутствуют на внутренней поверхности липидного слоя клеток BHK21-F.

В вмрионах гриппа обнаруживаются также гликолипиды, причем их локализацию на внешней 'поверхности двойного липидного слоя продемонстрировали агглютинацией вирионов с помощью специфических лектинов (Klenk et al., 1972а).

В интактных вирионах гликолипиды закрыты, но становятся доступными для лектинов после удаления поверхностных «шипов» с ломощью обработки протеазой.

Г. МЕМБРАННЫЙ БЕЛОК

Как уже было указано, при изучении с помощью электронного микроскопа окрашенных ультратонких срезов вирионов гриппа на внутренней поверхности вирусной оболочки наблюдается дополнительный слой с высокой электронной плотностью (см. 7 и 8). Этот слой не обнаруживается в нормальных цитсшлазматических мембранах (Apostolov, Flewett, 1969; Kendal et al., 1969; Compans, Dimmock, 1969; Bachi et al., 1969; Apostolov et al., 1970). В настоящее время существует несколько независимых групп аргументов в пользу того, что этот слой образован самым низкомолекулярным и наиболее широко представленным белком вириона, называемым мембранным, или матриксным, белком (М-белок). Доказательства эти следующие: 1) гликопротеиновые «шипы» могут быть удалены с помощью протеолитических ферментов при сохранении М-белка и слоя с высокой электронной плотностью (Compans et al., 1970a; Schulze, 1970, 1972; Kendal et al., 1969). После такой обработки кроме М-белка в составе вириона^, остаются только белок NP и Р-белки, и ни один из них не может быть ответствен за наличие слоя с высокой электронной плотностью. Несколько адолекул Р-белков, присутствующих в вирионе, не могут образовать такой слой, а белок NP находится во внутренней части вириона, входя в состав спирального нуклеокапсида; 2) расчеты показывают, что только М-белок присутствует в вирионе в (количестве, достаточном для формирования непрерывной оболочки толщиной 4—6 нм под двойным лиошдньш слоем (Compans et al., 1972; Schulze, 1972); 3) после экстракции липидов из фиксированных, лишенных поверхностных «шипов» вирионов

остается оболочка, которая может 'быть образована только М-белком (Schulze, 1972); 4) эксперименты с йодированием хлорамином Т показали, что М-белок, хотя и не расположен па поверхности вириона, является внешним по отношению к пуклеонротеиду (Stanley, Haslam, 1971); 5) исследования, .проведенные с помощью метода спектрофлуорометрии, показали возможность переноса энергии с М-белка на флюоресцентный зонд, внедренный в липидный бислой вириона (Lenard et al., 1974).

Приведенные аргументы указывают на тесную связь М-белка с внутренней частью мембраны; тем не менее этот белок, вероятно, не пронизывает насквозь двойной липидный слой и не выступает на внешнюю сторону мембраны. Это доказывается отсутствием действия на этот белок протеолити-ческих ферментов (Compans et al., 1970a; Schulze, 1970; Klenk et al., 1972a), недоступностью М-'белка для веществ, специфически реагирующих с поверхностными белками (Stanley, Ha'slam, 1971; Rifkin et al., 1972), и невозможностью обнаружить внутримембранные частицы при изучении мембран вируса гриппа с помощью метода сколов при замораживании (Bachi et al., 1969).

Из самого пространственного расположения М-белка, образующего каркас двойного липидного слоя, и того факта, что гликопротеиновые поверхностные «шипы» не играют основной роли в поддержании формы и целостности вирусной мембраны, можно сделать следующий вывод: вероятно, М-белок в вирусной оболочке играет основную структурирующую роль. Кроме того, этот белок обладает и другими функциями, которые вытекают из его расположения и свойств. Во время сборки оболочечных вирусов нуклеокапсид располагается под тем участком клеточной мембраны, который содержит вирусные поверхностные белки, что указывает на существование «узнавания» нуклеокапсидом этого участка мембраны.

Далее, во время сборки и отпочковывания вирусная оболоч-. ка формируется из клеточной мембраны, тем не менее в вирионе не содержится белков клетки-хозяина, что является дополнительным аргументом в пользу возможности миграции белков в плоскости клеточной мембраны. Эти факты наводят на мысль, что вирус имеет механизм для поддержания локализации своих компонентов вблизи той части клеточной мембраны, которая содержит вирусные белки и из которой удалены клеточные белки. Как уже предполагалось, наиболее вероятным кандидатом, осуществляющим как «узнавание» места локализации 'вирусного нуклеокаисида, так и поддержание вблизи мембраны вирусных компонентов, является М-белок (Choppin et al., 1972; Choppin, Compans, 1975; Compans, Choppin, 1975; Choppin, 1975).

НУКЛЕОКАПСИД

Внутренняя структура вирионов гриппа при негативном контрастировании препаратов проявляется достаточно редко, поэтому основная информация о структуре внутреннего ри-бо-нуклеоиротеида (РНП) была получена гари изучении изолированных РНП и вирусных частиц с помощью ультратонких срезов. Существует общее мнение, что РНП представлен в вир'Ионе в виде отдельных фрагментов, каждый из которых состоит из одной молекулы РНК, большого числа одинаковых молекул полипептада NP и, вероятно, из одной или нескольких молекул полимер-азы Р.

Ри'бонуклеоп'ротеид может быть выделен из вирионов в градиенте плотности после их разрушения с помощью обработки такими детергентами, как NP40 или эфир. Если структуры, полученные после такого выделения, исследовать с помощью негативного контрастирования уранилацетатом или фоефовольфрамовой кислотой (10 и 11), можно наблюдать нити диаметром 10—15 нм, длина которых варьирует в пределах 30—110 нм (Pons et al., 1969; Schulze et al., 1970; Corapans et al., 1972). Нити иногда имеют петли на одном из концов и хорошо различимые повторяющиеся следы глубокой и мелкой бороздок, свидетельствующих о том, что эта структура образована нитью, закрученной и свернутой в двойную спираль. На 12 [показана гипотетическая модель РНП. Препарат РНП можно фракционировать на несколько классов различающихся до размерам молекул с помощью скоростной седиментации, что отражает наличие в суммарной фракции фрагментов РНК с различной молекулярной массой (,Duesberg, 1969; Pon's, 1971). Фракции после разделения содержат структуры одинакового диаметра и существенно различной длины (Compans et al., 1972). Распределение по длине изолированных РНП было изучено в опытах с использованием в качестве контрастирующего вещества уранилацетата, который преимущественно связывается с нуклеиновой кислотой (см. 11). Наиболее быстро седимен-тирующий РНП имеет максимум на кривой распределения фрагментов по длине при 90—ПО нм, РНП со средними размерами — при 60—90 нм и самый короткий РНП — при 30— 50 нм. Эти значения длины РНП могут быть окоррелированы с молекулярной массой нуклеиновых кислот, входящих в состав РНП различных классов. Так, наибольший по размерам РНП содержит РНК с самой 'большой молекулярной массой— 106 (см. раздел II этой главы и гл. 6). В РНП приблизительно 10—12% массы приходится на РНК, а остальное — на белок, который практически полностью представлен еубъ-едивицами полипептида NP (Ponse et al., 1969; Krug, 1971). Используя эти данные, можно рассчитывать, что на  100 нм

нити РНП приходится около 150 субъединиц белка с молекулярной массой 60 000, т. е. один виток спирали РНП содержит приблизительно 12 субъединиц этого 'белка, и на одну белковую субъединицу приходится 20 нуклеотидов (Compans et al., 1972).

Исследование вирионов гриппа с помощью метода ультратонких срезов подтвердило ту точку зрения, что вирусный РНП представляет собой внутри 'вирусной частицы набор коротких фрагментов РНП (Compans, Dimmock, 1969; Bactu et al., 1969; Compan's et al., 1970b; Shulze, 1973). Вирионы в момент отпочковывания обычно слегка вытянуты и внутриви-русные нити РНП располагаются параллельно длинной оси частицы (Compans, Dimmock, 1969). Негативное контрастирование с помощью уранилацетата вирусных частиц, лишенных поверхностных «шипов» при обработке протеазой, выявило наличие большого количества внутривирусных нитей, морфология которых совпадала с морфологией РНП, изолированного из вирионов с помощью обработки детергентом (Schulze, 1973). Таким образам, различные методические приемы, позволяющие наблюдать внутреннюю структуру большего числа вирусных частиц популяции, обнаруживают, что РНП находится в вирусной частице во фрагментированном состоянии. При негативном контрастировании в некоторых вирионах наблюдаются большие бухтообразные структуры (Apostolov, Flewett, 1965; Almeida, Waterson, 1970; Schulze et al., 1970). Предполагалось, что эти структуры представляют собой «ин-тактные» нуклеокапсиды вирионов гриппа  и что РНП, изолируемый из вирусных частиц, является продуктом фрагментации этих структур (Almeida, Waterson, 1970). Однако наличие петель на одном из концов изолированной нити нук-леО'Протеида, а также тот факт, что длины нитей сгруппированы в дискретные группы (Compans et al., 1972), .подтверждают точку зрения, согласно которой полученные при изоляции из (вирионов нити РНП не являются прямыми продуктами фрагментации больших по размерам структур. Кроме того, как уже было описано, при исследовании ультратонких срезов вирусных частиц, когда разрешается внутренняя структура большинства вирионов, 'большие бухтообразные структуры обнаруживаются очень редко, а иногда и вообще не наблюдаются. В.некоторых случаях подобные структуры находят в инфицированных клетках, однако еще нет доказательств, что они имеют какое-либо отношение ,к вирусным РНП. Наличие связи этих бухтообразных структур с вирио-нами будет доказано только после их изоляции в чистом виде и определения их химического состава.

На основании высокой частоты рекомбинаций, характерной для вирусов гриппа (см. гл. 7), предполагалось, чтс» фрагменты РНП включаются в вирусную частицу из внутриклеточного резервуара случайно (Hirst, 1962). Хотя может быть строго доказано, что в результате такого случайного процесса лишь в редких случаях будут формироваться ви-рионы, содержащие все фрагменты генома, необходимые для осуществления инфекционное, тем не (менее относительное количество инфекционных вирионов в 'популяции вируса значительно увеличится, если вирионы будут содержать избыточное количество фрагментов РНК (Compans et al., 1970b). Доказательство случайного включения фралментов РНК в вирионы гриппа основывается на наблюдении Hirst и Pons (1973), заключающемся в том, что агрегаты вирионов гриппа, как обнаруживаемые при нормальных условиях, так и образуемые искусственно с помощью нуклеогистона, обладают повышенной инфекционностью. Эти результаты указывают на наличие комплементации двух или большего числа вирусных частиц, каждая из которых в отдельности не содержит •полного набора 'фрагментов РНК, необходимого для осуществления инфекционности.

Рибонуклеопротеид вируса гриппа по некоторым своим свойствам отличается от спирального нуклеокапсида пара-миксовируеов. РНК нуклеопротеида вируса гриппа в отличие от РНК в составе нуклеокапсида парамиксовирусов (Compans, Choppin, 1968) чувствительна к действию рибо-нуклеазы (Duesberg, 1969; Kingsbury, Webster, 1969; Pons. et al., 1969). Обработка РНП вируса гриппа поливинилсуль-фатом высвобождает РНК и образует .комплекс субъединиц .белка с поливинилсульфатом, структура которого очень сход-

на со структурой РНП (Pons et al., 1969; Goldstein, Pons, 1970). Нуклеокалсиды парамиксовирусов нечувствительны к такой обработке (Goldstein, Pons, 1970). Таким образом, механизмы взаимодействия РНК — белок для этих двух структур существенно различны, причем РНК вируса гриппа, входящая в состав РНП, вероятно, более доступна внешним •воздействиям.

Рибонуклеопротеид вируса гриппа чувствителен также к действию протеазы (Pons et al., 1969). При низких концентрациях проназы РНП не изменяет свои седиментационные параметры, однако при предварительной обработке препарата рибонуклеазой проказа приводит к деградации РНП (Duesberg, 1969). Следовательно проназа может расщеплять связи между субъединицами белка, не воздействуя на структуры, цельность которых определяется взаимодействием белковых субъединиц с молекулами РНК.

С РНП, изолированным из вирионов гриппа (Bishop, 1972) или из инфицированных им клеток (Caliguiri, Compans, 1974), вероятно, связаны минорные полипептиды Р. Поскольку в каждом фрагменте РНП может содержаться лишь несколько молекул этих полипштидов, кажется маловероятным, что они играют какую-либо роль в поддержании структуры РНП. Точная локализация молекул полипептидов Р пока неизвестна. Вероятно, они присоединяются к РНП менее прочно, чем молекулы полипептида NP, поскольку они могут удаляться во время очистки (Schulze, 1973). Минорные полипептиды Р могут входить в состав вирусной транскрип-тазы (Bishop et al., 1972) или 'быть инициаторными полипеп-тидами для «одевания» РНК белком РНП.

IV. СБОРКА ВИРИОНОВ

Сборка вирионов гриппа (см. гл. 8) осуществляется во время их отпочковывания от плазменной мембраны. Этот процесс будет рассмотрен в гл. 8 и ранее подробно обсуждался в литературе в отношении не только вирусов гриппа, но и других вирусов, 'формирующихся путем отпочковывания от клеточных мембран (Compans, Choppin, 1971, 1973, 1975; Choppin et al., 1971, 1972; Lenard, Compans, 1974; Compans et al., 1974; Klenk, 1973, 1974; Choppin, Compans, 1975). В связи с этим здесь мы лишь кратко суммируем данные о сборке вирионов гриппа, имеющиеся в настоящее время. РНП вируса гриппа синтезируется в цитоплазме и располагается под теми областями клеточной мембраны, которые содержат вирусные поверхностные белки. Затем вирион формируется за счет процессов отпочковывания и отделения от плазменной мембраны. Во время процесса отпочковывания элементарная мембрана   вновь  образующегося  вириона   соявляет одно целое с аналогичной мембраной, локализованной на поверхности хозяйской клетки (Compans, Dimmock, l%9; Bachi et al., 1969). Гликопротеиды, вероятно, сначала .пч'оциируются с внутриклеточными мембранами, а затем июдходят к плазменной мембране (Compans, 1973a, b; Stan-Icy et al., 1973; Klenk et al., 1974; Hay, 1974), что можно обнаружить с помощью специфической адсорбции эритроцитов м.ч плазменных мембранах 'Инфицированных клеток (Сот-p.-ins, iDimmock, 1969). Затем, вероятно, на внутреннюю по-iH'pxHocTb плазменной мембраны адсорбируется М-белок, формируя четко различимый слой с высокой электронной плотностью (Apostolov, Flewett, 1969; Compans, Dimmock, 1969; Bachi et al., 1969). Гликопротеиды и М-белок обнаруживаются в ассоциированном с плазменными мембранами виде при введении короткой пульсовой метки (Lazarowitz et al., 1!)71). Наличие М-белка, по-видимому, способствует образованию «посадочных мест» для РНП, затем инкорпорирующегося в вирионы при их отпочковании. Изменение формы плазменной мембраны, которое сопутствует отпочкованию, можно объяснить асимметричным растяжением внешней части двойного липидного слоя за счет внедрения в него поверхностных белков по механизму, сходному с механизмом, предложенным Sheetz и Singer (1974) для действия амфипатических .лекарств, индуцирующих изменение формы клеточных мембран. Процесс сборки вирионов заканчивается формированием целостных вирусных и клеточных мембран путем их «сплавления» в областях, где произошло отпочкование вирусных частиц. В результате этого процесса формируются либо сферические, либо филаментозные вирионы. Механизм, с помощью которого вирусный геном контролирует морфологию вирусных частиц, в настоящее время еще не выяснен.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. МОДЕЛЬ ВИРИОНА ГРИППА

На 12 приведена схематическая диаграмма вириона гриппа, основанная на известных в настоящее время сведениях об его структуре. Эта (модель отражает как хорошо установленные структурные данные, так и данные, которые еще требуют своего подтверждения. Как уже указывалось, в настоящее время имеют место альтернативные объяснения некоторых особенностей строения вириона гриппа. Не все детали структуры вирусной частицы нашли отражение на приведенной диаграм!ме (например, на ней не показано оли-гомерное строение поверхностных «шипов»). Эти детали обсуждаются в данной главе, а также в гл. 3 и 10. Существующие в настоящее время данные позволяют заключить, что информация о синтезе всех вирусных белков содержится в

вирусном геноме, а состав липидов и последовательность сахарных остатков в углеводных цепочках, присоединенных ,к гликоиротеидам или гликолипидам вирусной мембраны, определяются в большой степени, если не полностью, клеткой-хозяином. Вирионы могут (представлять собой либо сферические частицы диаметром 80—120 нм, либо филаментозные образования того же диаметра с различной длиной.

Поверхность вириона покрыта выступами или шипами. Эти шипы представляют собой олигомерные структурные образования, сформированные из гликопротеидов, обладающих либо гемагглютинирующей (НА), либо нейраминидазной (NA) активностью. «Шип» 'гемагглютинина состоит из трех НА-полипелтидов с молекулярной массой приблизительно 80 000, которые организованы в палочкообразную структуру длиной примерно 14 нм. В определенных условиях полипеп-тид НА может расщепляться с помощью протеолнтических ферментов на два полипептида HAj и НА2, связанных друг с другом дисульфидными связями. Такое расщепление не является необходимым условием для правильной сборки вириона и для осуществления гемагглютинирующей активности. НА2 — часть полипептида НА — гидрофобна и содержит в своем составе область, непосредственно взаимодействующую с вирусной мембраной.

«Шип» нейрамидазы сформирован четырьмя полипептидами NA с молекулярной массой около 55 000. Полипептиды представляют собой образования с утолщениями на конце диаметрохМ около 4 нм, которые сформированы в планарные структуры, имеющие вытянутые боковые проекции. Эти утолщения присоединены к нитеобразным «хвостам» длиной около 8 нм, погруженным в вирусную мембрану. Детальный механизм прикрепления поверхностных «шипов» к вирусной мембране еще не выяснен. «Шипы» как гемагглютинина, так и нейраминидазы имеют гидрофобные основания, способные присоединиться к двойному липидному слою мембраны 'вирусной частицы (за счет гидрофобного взаимодействия. Тем не менее поверхностные «шипы», вероятно, не пронизывают липидный слой насквозь и не погружены в него на значительную глубину (однако неглубокое проникновение возможно). «Шипы» могут быть удалены из вирусной мембраны без нарушения ее целостности.

На внутренней стороне двойного липидного слоя находится слой,. сформированный негликозидированным М-белком с молекулярной массой около 25 000. Предполагается, что этот белок может осуществлять в вирусной оболочке основную структурную роль, стабилизируя ее и, вероятно, определяя ее форму. Кроме того, этот белок может играть важную роль лри сборке вирусных частиц, с одной стороны, являясь своего рода «посадочной площадкой» на клеточной мембра-

не для нуклеокапсида, ас другой— ограничивая ту часть 'плазменной мембраны, которая содержит исключительно ви-руеспецифические белки.

Внутри вирусной оболочки содержится несколько фрагментов нуклеокапсида. Они представляют собой двухспираль-пые структуры разной длины, образованные субъединицами ислка NP с молекулярной массой около 60 000 и содержащие различные отрезки фрагментированного однонитчатого l'HK-генома. Внутри вирусной оболочки, кроме того, локализованы белки Р с молекулярной массой приблизительно ПО 000 (вероятно, они ассоциированы с нуклеокалсидом еще неясным в настоящее время образом). Функция этих белков пока не выяснена, однако предполагается, что они осущест-кляют вирусную транскриптазную активность.

 

ЛИТЕРАТУРА

Ada G. L., Gottschalk A. Biochem. J., 1956, v. 62, p. 686. Ada G. L., Perry B. T. Aust. J. exp. Biol. Med. Soc, 1954, v. 32, p. 453. Ada G. L., Perry В. Т., Abbot A.  J. Gen. Microbiol., 1958, v. 19, p. 23. Agrawal H. O., Bruening G. Proc.    Nat.    Acad.    Sci. U. S.,  1966

Almeida J. D., Waterson A. P.  J. gen. Microbiol., 1967, v. 46, p. 107. Almeida J. D.,  Waterson A. P. In: The    Biology    of    Large RNA Viruses

(R. D. Barry and B. W. J. Mahy, eds.), New York, Acad. Press,  1970

Apostolov K., Flewett Т. Н. Virology, 1965, v. 26, p. 506. Apostolov K., Flewett Т. Н. J. gen. Virol., 1969, v. 4, p. 365. Apostolov K-, Flewett Т. Н., Kendall A. P. In: The Biology of Large RNA

Viruses (R. D. Barry and B. W. J. Mahy, eds.), New York, Acad. Press,

1970, p. 3—26. Archetti  1.,  Jamelo A.,  Steve-Bocciarelli  D.  Arch.   ges.  Virusforsch.,   1967,

v. 20, p. 133. Bachi Т.,  Gerhard W., Lindenmann J., Muhlethaler K. J. Virol., 1969

Barry R. D., Bromley P. A., Davies P. In: The Biology of Large RNA Viruses  (R. D. Barry and B. W. J. Mahy, eds.), New York, Acad. Press,

1970, p. 279—300.

Bishop D. H. L., Obijeski J. F., Simpson R. W. J. Virol., 1971, v. 8, p. 74. Bishop D. H. L., Roy P., Bean W. J., Jr., Simpson R. W. J. Virol., 1972

Blough H. A. Virology, 1963, v. 19, p. 349.   

BloughH. A. J. gen. Virol., 1971, v. 12, p. 317.

Blough H. A. Nature (London), 1974, v. 251, p. 333

Blough H. A., Merlie J. Virology, 1970, v. 40, p. 685. Blough H. A., Tiffany J. M. Advan. Lipid Res., 1973, v. 11, p. 267. Blough H. A., Weinstein D. В., Lawson D. E. M., Kodicek E. Virology, 1967,

v. 33, p. 459. Brand С. М., Skehel J. J. Nature    (London),    New    Biol.,    1972, v. 238,

p. 145.

Bretscher M. Nature (London), New Biol., 1972, v. 236, p. 11.

Bucher D. J., Kilbourne E. D. J. Virol., 1972, v. 10, p. 60.

Caliguiri L. A., Compans R. W. J. Virol., 1974, v. 14, p. 191

Choppin P. W. Virology, 1963, v. 21, p. 278.

 

 «Вирусы гриппа и грипп»       Следующая страница >>>

 

Смотрите также:

 

Медицинская энциклопедия

Энциклопедия народного целительства

 

Поиск по библиотеке:

 

  Грипп - Д. Львов член-корреспондент АМН СССР

  

Грипп Grippe, Influenza. Воздушно-капельные инфекции

 

  ГРИПП И ОСТРЫЕ РЕСПИРАТОРНЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ. Народные средства от гриппа ...

 

  Простудные заболевания - ГРИПП

 

  Биография вируса. Д. Б. ГОЛУБЕВ профессор В. Е. ВИШНЯКОВ кандидат медицинских ...

 

  Грипп. Простуда - рецепты русской народной медицины и современной фармакопеи

 

  ВЗГЛЯДЫ НА ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА, СФОРМИРОВАННЫЕ НА ОСНОВЕ ...

 

  Грипп, парагрипп, аденовирусные инфекции и другие инфекции - В. В. ИВАНОВА

 

 Все результаты поиска (256)>>>