Медицинская литература

Вирусы гриппа и грипп

Раздел: Медицина 

Д. БУКЕР и П. ПАЛЕЙЗИ (BUCHER, P. PALESE)

I. ВВЕДЕНИЕ

Существование нейраминидазы впервые предположил в ставшей в настоящее время уже классической работе Hirst (1942). Он обнаружил, что если агглютинировавшие в присутствии ъируса гриппа эритроциты деагглютинировать, то при добавлении к ним 'нового вируса они вновь не способны к агглютинации. При этом, однако, элюированный вирус не теряет своей способности агглютинировать свежие эритроциты. Неизвестная субстанция изменяла свойства поверхности красных кровяных телец. Прозорливое предположение Hirst о том, что на поверхности вириона должен функционировать какой-то фермент, не соответствовало распространенной в то время точке зрения, согласно которой вирусы отличаются от бактерий в основном тем, что в их составе ферменты полностью отсутствуют.

Примерно до середины 60-х годов яе было известно, функционирует -ли нейраминидаза отдельно от гемагглютинина и является ли она самостоятельным белком. Hirst (1942) предположил, что явление гемагглютинации отражает связывание фермента с субстратом и оба явления — агглютинация и элю-ция — могут 'быть объяснены существованием одного фермента. Hirst (1942) указал на сходство рассматриваемой реакции с реакцией фермент — субстрат. Предполагалось, что образование промежуточного продукта 'взаимодействия фермента с субстратом, так 'Называемого фермент-субстратного комплекса, эквивалентно реакции гемагглютинации. После химической модификации субстрата фермент-субстратный комплекс распадается, и фермент восстанавливает способность адсорбироваться на новых молекулах субстрата и менять их химическую структуру. Hirst предположил, что понятию «субстрат» в реакции гемагглютинации соответствует некое вещество на шоверхности рецепторов эритроцитов и что оно  разрушается в результате     реакции    гемагглютинации.

Позднее Burnet (1951) подтвердил, что ферментативные и ге-матглютинирующие центры 'вириона идентичны.

После отделения нейрамияидазы от гемагглютинина, сначала с помощью протеолитического фермента трипсина (Мау-ron et al., 1961; Noll et al., 1962), а затем с помощью детергентов, таких, как SDS (Laver, 1963), стало ясно, что эти два компонента вириона являются индивидуальными белками. Однако абсолютное доказательство этого утверждения было дано после того, как стало возможным отделить индивидуальные в антигенном смысле нейраминидазу и гемагглю-тинин в опытах ло генетической рекомбинации и доказать их биохимическое и антигенное различие (Laver, Kilbourne, 1966). Ada и Lind (1961) предположили, что нейраминидаза может быть ферментом клетки-хозяина, включенным в ви-рион, .поскольку неинфицированные «летки куриных эмбрионов обладали нейраминидазной активностью, а аятисыворот-,ка к нейраминидазе вируса, выращенного in ovo, ингибиро-вала яейраминидазную активность клеток куриного эмбриона. Однако более -поздние работы показали, что хотя вирусный фермент антигенно сходен с ферментом системы, где вирус репродуцировался (in ovo или в клетках почек теленка), 'кросе-реажции между клеточной нейраминидазой и нейраминидазой вируса, вероятно, определяются наличием у этих ферментов общих детерминантов углеводной природы (Ada et al., 1963).

II. СПЕЦИФИЧНОСТЬ НЕЙРАМИНИДАЗЫ

Gottschalk (1957), Blix и соавт. (1957) установили, что фермент, входящий в состав вирионов гриппа, гидролизует гликозидную связь, соединяющую кетогруппу N-ацетилнейр-аминовой кислоты (NANA) с Ь-галактозой, D-галактозами-ном или, возможно, с другими сахарами. За ферментом утвердилось название «нейраминидаза» — NA (Gottschalk, 1957). Кроме того, для обозначения фермента часто употребляется термин «сиалидаза». Эти названия являются отражением того, что фермент отщепляет вещество, которое называют либо нейраминовой, либо сиаловой кислотой (Heimer, Meyer, 1956). Номенклатурное название нейраминидазы, согласно «Номенклатуре ферментов» (1965),—мукополисаха-рид Ы-ацетилнейраминилгидролаза, ЕС 3.2.1.18. Фермент гидролизует связь между терминальной сиаловой кислотой и соединенной с ней с помощью а-связи молекулой сахара. Обзоры работ по изучению свойств бактериальных и вирусных нейраминидаз были опубликованы Drzeniek (1972, 1973), а также Gottschalk и Drzeniek (1972).

В природных нейраминовых .кислотах аминогруппа при углеродном атоме Cs всегда замещена на N-ацетил- или на

N-гликолильную группу, а гидраксильная группа (группы) иногда О-ацетилирована (Blix et al., 1957; Gottschalk, 1960). О-ацетильные группы замещают тидроксилы в положении 4, 7 или 8 и легко отщепляются после обработки разбавленными щелочами или кислотами. У большинства животных N-ацетил- и N-гликолилнейраминовые кислоты существуют в одно и то же время, причем отношение их содержания различно для разных видов животных и для разных тканей и секреторных выделений в случае одного вида (Gottschalk,. I960). Специфичность нейраминидазы зависит от вида заместителя при атоме азота в сиаловой кислоте субстрата; N-ацетильная форма расщепляется нейраминидазой вируса гриппа с гораздо большей скоростью, чем N-гликолилнейр-аминовая кислота (Flockton, Hobson, 1970). Было показано,, иго нейраминидаза вируса гриппа является высокоспецифичным ферментом и что ее специфичность отличается от специфичности бактериальных нейраминидаз (Drzeniek, 1972). Используя синтетические производные нейраминовых кислот, Meindl и Тирру (1966а) показали, что для того, чтобы гид-ролизовать субстрат с помощью нейраминидазы, абсолютно необходимо присутствие свободной карбоксильной группы. Замещение N-ацетильной группы более объемными группами, такими, как бензоильная, бутильная или бензилоксикарбо-нильная, превращает нейраминсодержащий субстрат в устойчивое соединение для гидролиза бактериальными нейрами-нидазами (Meindl, Tuppy, 1966; Faillard et al., 1969). Чувствительность субстратов к гидролизу вирусными нейрамини-дазами значительно снижается после окислительного отщепления от молекулы нейраминовой .кислоты углеродного атома Сэ или атомов Cs и Сд. Это указывает на высокую структурную специфичность действия нейраминидазы (Suttajit, Winz-ler, 1971).

Природа связи нейраминовой кислоты с углеводной частью (агликогон) также важна для специфичности действия нейраминидазы. Основываясь на результатах, полученных с использованием природных субстратов, в большинстве которых нейраминовая кислота связана с агликоном а-евязью, был сделан вывод, что нейраминидаза расщепляет только а-связи (Gottschalk, 1957, 1958; Kuhn, Brossmer, 1958). Используя синтетические субстраты, Meindl и Tuppy (1966a, b) показали, что фермент не отщепляет нейраминовые кислоты, присоединенные к агликону (З-связью. Строение атлвкояа, по-видимому, не играет существенной роли (Schauer, Faillard, 1968).

Углеродный атом С2 нейраминовой кислоты может быть соединен с углеродными атомами С3, С6 и, возможно, С4 галактозы, углеродным атомом С6 N-ацетилгалактозамина, углеродным атомом С6 ацетил^-глюкозамина или с Cg другой

молекулы нейраминовой кислоты (Drzeniek, 1973). Нейрами-новая .кислота всегда находится на конце цепи, если она не присоединена к другой молекуле нейраминовой кислоты связью (а, 2—*8) (Gottschalk, Drzeniek, 1972). Бактериальные нейраминидазы действуют преимущественно на а-кето-зидные связи, такие, как (а, 2—*3), (а, 2—>~4), ,а, 2——иб) и (а, 2—->-8), а вирусные нейраминидазы, такие, например, как нейраминидаза вируса болезни Ньюкасла и вируса чумы птиц (FPV), в основном гидролизуют связи 2—ьЗ (Drzeniek, 1967, 1972, 1973). Обе эти вирусные нейраминидазы относительно неактивны в отношении связей 2—Иг и 2—йЗ (Drzeniek, 1967; Huang, Orlich, 1972), а связь 2—>-8 расщепляет нейраминидаза FPV (Drzeniek, Gauhe, 1970).

III. СУБСТРАТЫ ДЛЯ НЕЙРАМИНИДАЗЫ

А. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ N-АЦЕТИЛНЕЙРАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Метод, который обычно используют при определении концентрации нейраминовой .кислоты, включает образование окрашенного соединения при добавлении тиобарбитуровой кислоты. Он был разработан Warren (1959, 1963) и модифицирован Aminoff (1959, 1961). Метод позволяет измерять концентрацию свободной «ейраминовой кислоты в присутствии связанной ацетилнейраминовой кислоты. Если выход окрашенного продукта при определении концентрации N-ацетил-нейра-миновой кислоты принять за 100%, то его выход при проведении реакции с производными нейраминовой кислоты будет составлять: для N-гл'Иколилнейраминовой кислоты — 63%, М-ацетил-4-0-а|цетилнейрам|Иновой кислоты—100%, N-ацетил-8-О-ацетилнейрам'ИНовой кислоты — 47% и N-ацетил-7-О-ацетилнейраминовой кислоты — 0%   (Drzeniek,   1972).

Б. ПРИРОДНЫЕ СУБСТРАТЫ

Нейраминидаза уникальна по своей способности взаимодействовать с субстратами самых различных размеров (Ci-nader, 1967) —от сиалиллактозы с относительной молекулярной массой (ОММ) 633 до овомукоида (ОММ 44 000) и от фетуина (ОММ 48400) до чгдикопротеида, выделенного из мочи (ОММ 7-Ю6).

Все субстраты можно разбить иа две группы — высокомолекулярные и низкомолекулярные. Низкомолекулярные природные субстраты охарактеризованы полнее и, вероятно, ограничиваются лишь одним примером:   N-ацетилнейраминилла'ктозой

или сиалиллактозой (17). N-ацетилнейраминиллактозу впервые изолировали из молозива крупного рогатого скота (Kuhn, Brossmer, 1958). Она содержала около 8—14% а, 2—>~6) связей и около 72% связей типа (а, 2—>-3) (Sehneir, Rafelson, 1966; Ohman, Hygstedt, 1968). Молекулы со связью типа (л, 2—хб) могут быть отделены от молекул со связью (а,2—>-3) с помощью ионообменной хроматографии по методу, описанному Sehneir и Ralelson (1966). В идеальном случае в качестве субстрата для нейраминидазы вируса гриппа должна быть использована N-ацетилнейраминиллактоза типа (а, 2—>-3), однако обычно для этой цели используют смесь изомеров двух типов. В качестве субстрата для нейраминидазы, «роме того, используют низкомолекулярные синтетические соединения, свойства которых будут описаны далее.

В природе существует много высокомолекулярных соединений, содержащих сиаловые кислоты. При определении пригодности субстрата для проведения количественного определения нейраминидазы вируса гриппа необходимо знать гомогенность и чистоту субстрата. Имеет значение тип сиа-ловой кислоты (например, N-ацетил-, N-гликозил- или O.N-диацетилнейраминовая кислота), содержащейся в субстрате. Пригодность вещества для работы с вирусными нейрамини-дазами определяется также тем, какой вид связи: '(а, 2—>-3), (а, 2—>-8) или (а, 2—*8) существует между нейраминовой кислотой и агликоном. Ранее в качестве субстратов использовали большое число гликопротеидов, содержащих опаловую кислоту, но только немногие из них были охарактеризованы с биохимической точки зрения.

Фетуин, аг-гликопротеид эмбриональной сыворотки теленка, является наиболее распространенным субстратом, впервые использованным в тестах на вирусную нейраминидазу. Spiro (1960) выделил фетуин из эмбриональной сыворотки теленка с выходом 17% от общего содержания белков сыворотки. Сиаловая кислота составляет 8,7% общей массы полипептида, относительная молекулярная    масса    которого

равна 48 400. Сиаловая кислота находится в основном в N-ацетильной форме с содержанием N-гликолилнейрамино-вой кислоты 7% от общего количества сиаловой .кислоты. Условия для определения иейраминидазы с использованием фе-туина в качестве субстрата были стандартизированы для об-наоужения нейраминидазных антител (Aymard-Henry et al., 1973).

В качестве нейраминидазного субстрата часто используют также муцины из подчелюстных желез. Содержание N-гли-колил- или N-ацетилнейраминовой .кислоты (варьирует в зависимости от источника выделения муцина (Gottschalk et al., 1972). Например, муцин, выделенный из подчелюстной железы овцы, содержит в основном N-ацетилнейраминовую -кислоту, в состав муцина, выделенного из подчелюстной железы свиньи, входит преимущественно N-гликолилнейраминовая кислота, а в состав бычьего муцина входит как N-глнколил, так и N-ацетилнейраминовая .кислота. Поскольку нейрами-нидаза вируса гриппа расщепляет N-ацетильную форму нейр-аминовой кислоты с большей эффективностью, чем N-глико-лильную форму (см. раздел II), лучшим субстратом можно считать муцин, выделенный из подчелюстных желез овцы. Мукоид ласточек (рода Collocalia), выделенный из съедобных птичьих гнезд, предложили в качестве субстрата для нейраминидазы Howe и соавт. (1961). Нейраминовая кислота составляет приблизительно 9—13% массы мукоида. Однако большое число ацетогрупп нейраминовой кислоты присутствует в нем не в N-ацетильной, а в О-ацетильной форме (Ка-than, Weeks, 1969). В качестве субстрата для нейраминидазы вируса гриппа использовали также орозомукоид—си-кислый гликопротеид сыворотки человека  (Rafelson et al.,  1963a).

При сравнении скоростей отщепления N-ацетилнейраминовой кислоты от некоторых (высокомолекулярных субстратов Rafelson и соавт. (1963а) определили, что если принять количество NANA, отщепляемого от сиалиллактозы, за 100%, то от мукоида Collocalia отщепилось 26%, от гаптоглобина 1-1—23%, от гаптоглобина 2-2 — 22%, от орозомукоида — 17%, от ингибитора, изолированного из стром эритроцитов,— 10%, от гликопротеида мочи — 5% N-ацетилнейраминовой кислоты. Однако, хотя и имеется большое различие в скоростях отщепления, абсолютное количество отщепляемой за достаточное время от указанных субстратов нейраминовой кислоты менялось в пределах 58—85%, если за 100% принять отщепление от сиалиллактозы.

Совсем мало известно о реальных субстратах, подверженных действию нейраминидазы во время репликации вируса гриппа in vivo. Известно, что нейряминидаза отщепляет нейраминовую кислоту от поверхностного рецептора эритроцитов при элюции с них вирионов гриппа. Этот рецелторный

белок — гликопротеид с относительной молекулярной массой около 31000 — был выделен в чистом виде и обладал М- и N-группоспецифической активностью крови (Kathan, Winzler,. 1963; Winzler, 1972). Аналогичные гликопротеиды других клеточных мембран не были изучены так же подробно.

В. СИНТЕТИЧЕСКИЕ СУБСТРАТЫ

Большое 'количество синтетических субстратов для нейраминидазы было получено с помощью присоединения ароматических и алифатических спиртов к С2 углеродному атому различных производных нейраминовой .кислоты (Tuppy, Gottschalk, 1972). ЭТИ синтетические субстраты можно приготовить с высокой степенью чистоты. Они могут помочь в понимании механизма специфичности различных нейраминидаз. Meindl и Tuppy (1967) предложили использовать в качестве удобного кристаллического субстрата для нейраминидазы фенилкетозид N-ацетилнейраминовой кислоты: 2-фенил-^ ацетилнейраминовую кислоту. Отщепляемый в этом случае фенол определяли с помощью фенольной реакции Фолина. И. М. Привалова и А. Я- Хорлин (1969) описали синтез 2-р-нитрофенил-^ацетилнейраминовой кислоты, которую также можно использовать в качестве удобного субстрата для нейраминидазы. Подобный субстрат — 2-(О/-метоксифенил)-г\1-ацетилнейраминовая кислота (МФН) (Tuppy, Palese, 1969) можно успешно применять в качестве субстрата с использованием фенольной реакции Фолина (Palese et al., 1973). Другую методику использования МФН в качестве субстрата описали Sedmak и Grossberg (1973). После ферментативного отщепления МФН отщепленный 3-метоксифенол (МФ) определяют как солюбилизированный комплекс диазониевой соли с МФ. Белок в высокой концентрации мешает определению* свободного фенола по методу Фолина (Palese et al., 1973), но не играет роли в МФ-диазониевом методе (Sedmak, Gross-berg, 1973), что позволяет проводить определение нейрами-нидазной активности тотальных вирусных препаратов. МФН также использовали для обнаружения нейраминидазной активности в полиакриламидных гелях и целлюлозоацетатных пластинах (Tuppy, Palese, 1969; Bucher, Kjlbourne, 1972), а также для окраски бляшек вирусов, содержащих нейрами-нидазу (Palese et al., 1970, 1973). Для обнаружения вируса с помощью метода бляшек в монослой клеток вводят вирус гриппа или парагриппа, и на монослой наносят слой агара. После необходимой инкубации добавляют субстрат и диазо-ниевую соль 4-амино-2,5-диметоксинитразобензола, которые диффундируют сквозь агар. В местах репликации вируса субстрат гидролизуется и образует с диазониевой солью нерастворимый продукт красного цвета (18). Из этих фокусов может быть изолирован инфекционный вирус.

Недавно был синтезирован флюоресцирующий субстрат для нейраминидазы — 4-1метилилум'беллиферрил-Г\[-ацетил-нейраминовая кислота (Palese, неопубликованные данные). Субстрат позволяет -быстро и с высокой чувствительностью определить нейраминидазную активность. Разработка такого рода субстратов должна облегчить исследование по изучению свойств нейраминидазы, а также помочь в разработке методов ее выделения и количественного определения. Конфигурация этих субстратов может помочь в дальнейших исследованиях природы активного центра фермента.

IV. ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НЕЙРАМИНИДАЗЫ

А. КОНСТАНТА МИХАЭЛИСА

Константа Михаэлиса (Км) отражает степень сродства фермента к субстрату и является параметром, который можно использовать для сравнения нейраминидаз, выделенных из различных штаммов. Величины Км для различных штаммов вируса     гриппа  при  использовании  в     качестве    субстрата М-ацетилсиалилла.ктозы (а, 2—>~3) равны: PR8 (N1) Км = = 1,0-Ю-3 М, оптимум рН 7,0; А2 (Япония)/305/57 (N2) Км = = 2,0-Ю-4 М, оптимум рН 6,5; FPV Км = 4,0-10^4 М, оптимум рН 6,0; B/Lee Км = 2,0-10~4 М, оптимум рН 6,8; данные суммированы в работе Gottschalk и Drzeniek (1972). Как величина Км, так и оптимальное значение рН являются субстрат-зависимыми величинами.

Используя синтетический субстрат МФН при рН 5,8, Sed-mak и Grossberg (1973) нашли, что величина Км для нейраминидазы штамма A0/NWS/39 (N1) равна 3,5 ■ 10—3 М, а для нейраминидазы, выделенной из A2/R 15+/57, Х7 и X7(F1) (N2), эта величина равна 6,5—6,9• 10~4 М, что указывает на пятикратное различие в сродстве к субстрату этих двух типов нейраминидаз. Как для сиалиллактозы, так и для МФН нейраминидаза типа N2 имеет в 5 раз большее сродство к субстрату, чем нейраминидаза типа N1. Однако абсолютное сродство Км обоих типов нейраминидаз к сиаллактозе в 3 раза ъыше, чем к МФН.

Б. ОПТИМУМ рН

Оптимальное для  работы  нейраминидазы вируса  гриппа значение рН зависит от штамма вируса и используемого субстрата. В отличие от кислых значений рН, оптимальных для нейраминидаз бактерий и млекопитающих, аналогичные значения  для  нейраминидазы  вируса  гриппа  обычно  сдвинуты в щелочную сторону и более близки к нейтральным значениям рН. Kendal и Madeley  (1969), используя в качестве субстрата сиалиллактозу, иашли, что для (большого числа штаммов  вируса   грдоша,  включая   штаммы   вирусов   гриппа   АО, A1(N1), A2(N2), В, а также вируса А птичьего происхождения,  оптимум  рН  лежит  в  пределах  6,4—7,0.  Оптимальное значение рН  зависит также от вида связи,     расщепляемой ферментом. Schneir и Rafelson  (1966)  определили, что нейраминидаза   (N2)   расщепляет    химическую    связь   (а, 2—>-3) с максимальной скоростью гари рН 6,5, в то время как та же нейраминидаза для расщепления связи  (а, 2—>-6)   имеет оптимальное значение рН 4,5.  Однако максимальная скорость расщепления   (а, 2—>-6)  N-ацетилсиалиллактозы    составляла, только 6%   от аналогичной скорости для   (а, 2—>-3)   формы субстрата.

В. ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОДУКТОМ РЕАКЦИИ

Нейраминидаза вируса гриппа 'конкурентно ингибируется. продуктом нейраминидазной реакции — N-ацетилнейрамино-вой кислотой, хотя для этого требуются относительно высокие концентрации нейраминовой    кислоты.    Walop и соавт. (1960), используя в качестве субстрата сиалиллактозу, определили Ки = 5,0-10-3 М для нейраминидазы штамма A2/57/Sing (N2). Rafelson и соавт. (1963b) для штамма PR8 (N1) определили Ки = 2-10^2 М и Ки=4-10-3 М для азиатского штамма при опти-мумах рН 7,0 и 6,5 соответственно. Это означает, что сродство нейраминидазы N2 к продукту реакции в 5 раз выше, чем аналогичная величина для нейраминидазы N1. Такое же соотношение существует между сродством Км нейраминидазы N2 н Ki к субстрату ферментативной реакции.

Г. ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ И ПОТРЕБНОСТЬ В ИОНАХ КАЛЬЦИЯ

Хотя эти два свойства на первый взгляд кажутся совершенно независимыми, появляется все больше фактов, указывающих на их связь. Burnet и Stone (1947) показали, что нейраминидаза Vibrio cholerae имеет температуру инактивации на 8°С выше в (Присутствии ионов 2+Са, чехМ в их отсутствие. Сходный эффект был продемонстрирован для нейраминидазы вируса гриппа штамма B/Lee. Boschman и Jacobs (1965) обнаружили, что нейраминидаза штаммов FMl(Nl), А2 Япония (N2) и B/Joh резко повышают свою температурную чувствительность после обработки ЭДТА. Было, "кроме того, показано, что термостабильность и потребность в ионах .кальция меняются от штамма к штамму (Boschman, Jacobs, 1965; Dimmock, 1971). Нейраминидаза штамма АО(WSN) (N1) полностью теряет свою активность после прогрева в отсутствие Са2+ (Dimmock, 1971). Если же в растворе имелись Са2+, то 35% активности сохранялось. Ионы магния не могут заменить Са2+ для получения эффекта стабилизации. Действие Са2+ может быть обратным в присутствии ЭДТА.

Необходимость Са2+ для работы нейраминидазы, вне ее связи с фактором термостабильности, была предметом дискуссии в течение нескольких лет. Хотя повышение активности было налицо, трудно 'было показать абсолютную необходимость для работы фермента присутствия именно Са2+. Wilson и Rafelson (1967), удаляя ионы кальция с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом или с помощью добавления ЭДТА для полного связывания их следов, показали снижение на 20% активности нейраминидазы N2; максимальную активность можно получить, добавив 0,1 мМ Са2+. Почти абсолютная необходимость присутствия ионов кальция была показана Dimmock (1971) для нейраминидазы WSN(Nl). В отсутствие Са2+ ак~чвность нейраминидазы составляла около 1 % исходной активности, для получения максимальной активности требовалось 3 мМ Са2+. Нейраминидаза типа N2 (Япония) требовала для своей максимальной активности 0,3 мМ 2+Са. Та'ким образом, имеется десятикратное различие

в потребности в ионах 'кальция для нейраминидазы типа N1 и нейраминидазы типа N2. Особые трудности возникают при изучении действия малых (концентраций ионов кальция (особенно в случае нейраминидазы N2) в связи с тем, что 'большинство субстратов содержат двухвалентные ионы в количествах, достаточных для обеспечения потребности вирусной нейраминидазы (N2) в ионах кальция (Wilson, Rafelson, 1967).

В нескольких работах по изучению термостабильности было показано, что NA типа N1 относительно термолабильна, a NA типа N2 термостабильна. Rafelson и соавт. (1963а) показали, что нейраминидаза PR8(N1) полностью инактивиру-ется при нагревании до 55 °С в течение 30 мин, в то время как нейраминидаза азиатского штамма (N2) сохраняет 67% своей активности при аналогичной обработке. Paniker (1968) обнаружил, что термостабильность нейраминидазы вируса гриппа меняется в широких пределах. Штаммы A2(N2) обладают наиболее термостабильным ферментом, на активность которого не влияет нагревание в течение 1 ч при 45°С, а нейраминидаза штаммов NWS и WSE(Nl) наиболее термолабильна.

V. СОДЕРЖАНИЕ НЕЙРАМИНИДАЗЫ В ОБОЛОЧКЕ ВИРУСА

Как было определено, для таких штаммов вируса гриппа, как А0/Ве1/42, который содержит нейраминидазу типа N1 (Skehel, Schild, 1971), как рекомбинант Х7, в состав которого входит нейраминидаза типа N2 (Laver, Kilbourne, 1966) и вируса гриппа В, штамм B/Lee (Laver, 1963), содержание нейраминидазы составляет около 7% от суммарного содержания белков в вирионе. Несмотря на совпадение величин, полученных в этих работах, было обнаружено, что количество нейраминидазы, включающейся в вирусную частицу, может быть недостаточным и зависит от типа клеток, на которых выращивают вирус, и от штамма вируса. Laver (1963) обнаружил, что количество NA* зависит от типа клеток-хозяев и составляет 6% от общего вирусного белка при выращивании вируса in ovo и 14%, если вирус выращивается на клетках почки теленка. Laver и Kilbourne (1966) обнаружили, что в рекомбннантном штамме X7(F1) (H0N2) содержится в 2 раза больше «ейраминидазы, чем в штамме X7(H0N2) при выращивании вирусов in ovo. Palese и Schulman (1974) обнаружили десятикратное различие в содержании нейраминидазы в двух антигенно идентичных лабораторных рекомби-нантах вируса гриппа (H0N2), выращенных in ovo. Mow-showitz и Kilbourne (1975) наблюдали подобные различия в нейраминидазной активности изолированных вирусов двух

штаммов Aichi (H3N2) дикого типа. Используя метод подсчета частиц, Seto (1964) обнаружил, что неполный вирус штаммов PR8 (H0N1) и Япония/305 (H2N2) обладает нейр-аминидазной активностью, в 2—4 раза меньшей, чем стандартный вирус.

Если считать, что содержание NA* составляет 7% суммарного (белка вириона (а белок составляет 70% массы всей вирусной частицы) (Frommhagen et al., 1959), и принять за массу одной вирусной частицы величины W = 4-10~16 (Reimer et al., 1966), то число молекул NA* на один вирион можно определить из следующего уравнения (Skehel, Schild, 1971). Предполагается, что NA* представляет собой тетрамер с относительной молекулярной массой 24 000 (Wrigley et al., 1973), а N — число Авогадро:

^%NA = 49 молекул NA па вирион

Kendal и соавт. (1968) определили абсолютное содержание белка на один вирион, равное 4-Ю-16 г, и, основываясь на содержании NA* в 10% от суммарного белка вириона и на ее молекулярной массе в 220 000, рассчитали, что в вирионе гриппа штамма А/Сингапур/1/57 (H2N2) содержится 100 молекул NA* на одну вирусную частицу. Поскольку, согласно расчетам Tiffany и Blough (1970), на поверхности вирусной частицы содержится 550—600 «шипов», можно считать, что 50—100 из них представляют собой NA*, а остальные 500—'НА*.

А. СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ НЕЙРАМИНИДАЗЫ

Для изучения свойств NA* (как ферментативных, так и антигенных) удобно иметь 'фермент, отделенный от других компонентов вирусной оболочки. Поскольку NA* локализована в вирусной оболочке, именно это предопределяет способы ее солюбилизации и отделение от вириона и других вирусных компонентов. Методы солюбилизации NA* можно разделить на две группы: а) солюбилизация с помощью протеолитиче-еких ферментов и б) солюбилизация с помощью поверхностно-активных веществ. Особенности выделения NA* с помощью обоих методов приведены в табл. 13.

Солюбилизация .NA*, по-видимому, не меняет ее ферментативных свойств. Активная в биологическом и антигенном отношении NA* была выделена протеолизом или с помощью поверхностно-активных веществ ионной и неионной природы (Drzeniek et al., 1966). После выделения NA* имела ту же, что и до выделения, величину Км, оптимум рН и Са2+-зави-симость (Drzeniek et al,, 1966). Выделенную из вириона после обработки детергентами или протеолитическими ферментами iNA* нейтрализовали антисывороткой в той же степени, что и NA* интактного вириона (Ea'sterday et al., 1969). Одна-

ко Webster и Laver (1967) обнаружили, что выделенная с помощью детергента -NA* типа N2 обладает «дефицитом» анти-генности по сравнению с антигенностью NA* того же типа in situ.

Было показано, что iNA* вируса гриппа штамма B/Lee является наиболее стабильной и может -быть выделена практически с 100% выходом после обработки вирионов SDS или трипсином (Laver, 1963). NA* вируса B/Lee, кроме того, нечувствительна к дезоксихолату натрия (Laver, 1963). Что .касается вируса гриппа типа А, то наиболее просто с помощью обработки SDS или протеолитическими ферментами выделяется -NA* из штаммов А2 (N2). Эта NA*, кроме того, относительно температурно-етабильна. Использование нейтральных детергентов позволило выделить NA* типа N2 (Webster, Darlington, 1969), а также iNA* типа N1, выделение которой в чистом виде особенно трудно (Gregoriades, 1972). Hoyle и Almeyda (1971) показали, что NA*, выделенная из штаммов вируса гриппа типа А2 (N2) и B/Lee, почти полностью устойчива к действию проназы и трипсина; NA*, выделенная из штаммов PR8 (N1) и свиного (N1), лишь отчасти устойчива, a NA* вируса гриппа типа А1 (N1) и штамма A/DSP (<N1) крайне чувствительна к проназе и трипсину. NA* вируса гриппа типов АО и А1, (Которые также чувствительны к действию протеолитических ферментов, разрушается под действием SDS и мочевины (Hoyle, Almeyda, 1971).

Для солюбилизации NA* такие методы, как разрушение ультразвуком, эфиром или денатурирующими агентами (мочевина или гуанидингидрохлорид), применимы в малой степени, вероятно, в связи ,с высокими агрегационными свойствами этого фермента. Разрушение вирионов с помощью эфира, по-видимому, высвобождает НА* и NA* в виде сополимер-ного агрегата (Hoyle, 1952; Davenport et al., 1960; Schafer). Этот вид разрушения вирусных частиц в основном использовали до того, как Laver изолировал NA* (Hoyle, 1952; Lief, Henle, 1956; Paucker et al., 1959; Hoyle et al., 1961).

Предпочтительным является такой ,вид изоляции NA*, который не требует разрушения ковалентных связей. Использование детергентов для солюбилизации iNA* позволяет выделить и другие вирусные белки, которые в химическом отношении не отличаются от соответствующих вирусных компонентов, хотя и могут терять свою биологическую активность (Bucher, 1975). По-видимому, при протеолитической солюбилизации NA* теряет некоторую часть своей молекулы, необходимую для удержания фермента на вирусной оболочке и не участвующую в ферментативном акте. Lazdins и соавт. (1972) показали, что в отличие от изоляции NA* с помощью детергента (SDS) или лротеолитичеоком (трипсин) выделении из штамма B/Lee каждая субъединица фермента теряет

отрезок -молекулы в 7000; по данным Wrigley и соавт. (1973), при тех же условиях каждая субъединица NA* B/Lee теряет участок в 12 000.

Основное различие, наблюдаемое при лротеолитическом и детергентном выделении NA*, состоит в том, что при солюби-лизации с помощью протеолитичеоких ферментов она теряет способность к агрегации. При (протеолитичеоком выделении имеет место «действительная» солюбилизация, в то время как iNA*, полученная с помощью детергентов, агрегирует при удалении солюбилизирующего агента (Lazdins et al., 1972). Каждый этап очистки NA* после ее солюбилизацин с помощью детергента должен выполняться в его присутствии для того, чтобы, во-первых, иметь дело с ферментом в диссоциированном состоянии, а Ео-вторых, для предотвращения потери его активности. Laver и Valentine (1969), а также Rott и соавт. (1970) показали наличие агрегатов в препаратах iNA* типа N2 при удалении детергента. По данным Grego-riades (1972), при удалении детергента NA* штамма WSiN (N1) агрегирует и теряет свою активность. Webster (1970b) обнаружил высокую агрегационную способность для NA*, выделенной из вирионов с помощью детергента, даже в присутствии 6 М гуанидингидрохлорида в условиях восстановления.

1. Использование протеолитических ферментов

Протеолитические ферменты различной специфичности или смесь протеолитических ферментов (таких, как пролаза) могут использоваться для солюбилизации NA* в активной форме. Это свидетельствует, во-первых, что активный центр NA* в высокой степени устойчив к протеолизу и, во-вторых, что отрыв гидрофобного «хвоста» может быть осуществлен практически любым протеолитвческим ферментом. Для отщепления необходимо наличие нескольких ключевых аминокислот; произойдет ли гидролиз в том или другом месте — не имеет большого значения. Протеолитические ферменты обычно попользуются в высоких концентрациях (1—2 мг/мл и выше), которые сравнимы с .концентрацией вирусных (белков при малом времени инкубации. Поскольку NA* вируса находится в «нативном» состоянии, она, по-видимому, более устойчива к протеолизу, чем после денатурации фермента. Углеводные остатки NA* могут играть роль «защитников» фермента от атаки протеолитичеокими ферментами, а также «направлять» протеолитические ферменты к специфическим областям, в которых должен произойти разрыв цепи. Что касается ферментов, используемых для солюбилпзации NA*, то следует отметить, что трипсин, обладая  наивысшей  из  всех

известных эндопептидаз степенью специфичности места разрыва, расщепляет |бело,к в области карбоксильного конца остатков лизина и аргинина (Walsh, 1970). Химотрипсин расщепляет белок преимущественно по ароматическим аминокислотам полипептидной цепи (Wilcox, 1970). Пептидаза На-гарсе (или субтилизин BPN') является сериновой протеазой, расщепляющей большое число пептидных и эфирных связей (Ottesen, Svendsen, 1970). Проназа представляет собой смесь нескольких протеолитических ферментов, включая эндопеп-тидазу и экзопептидазу, .продуцируемые штаммом Streptomy-ces griseus K-l (Narahachi, 1970).

2. Использование детергентов

Детергенты, используемые для изоляции вирусных <NA:1\ можно разбить на две основные группы: ионные (преимущественно анионные) и неионные детергенты. К числу основных детергентов первой группы, используемых для солюбилизации NA* с сохранением ее ферментативной активности, следует отнести додецилсульфат натрия (SDS) и дезоксихолат натрия. Оба вещества относятся к числу сильных детергентов анионного типа. NA* штаммов A0(Nl) чувствительна к SDS (Gregoriades, 1972; Laver, Baker, 1972) и инактивирует-ся в присутствии этого детергента, в то время как NA* штаммов А2 (N2) может быть изолирована с помощью SDS-co-любилизации. Отношение 2:1 по массе белка к детергенту является оптимальным для изоляции NA* типа ;N2 с сохранением ее активности (Laver, 1963; Rott et al.. 1970). Использованные ранее неионные детергенты относились к серии твинов: твин-20 или твин-80, часто в смеси с эфиром. Позднее использовали детергент NP40 (Gregoriades, 1972) и тритон Х100 (Bucher, 1973, 1975). Неионные детергенты обычно обладают более низкой инактивирующей способностью, чем ионные. Как и в случае протеолитических ферментов, тип детергента не оказывает существенного влияния на свойства выделяемого фермента в случае, если не происходит его инактивации.

Успешное выделение NA* в активном состоянии с помощью электрофореза в целлюлозоацетатных пластинах (Laver, 1963, 1964) в присутствии SDS зависит от того, имеем ли мы дело с SDS-чувствительным НА* и SDS-нечувствительной NA*, После разрушения вирусных частиц с помощью SDS NA*, мигрирующая под действием эндооомотического потока, движется к катоду и отделяется от НА*. Для штаммов типа А2 НА* и NA* мигрируют совместно (к катоду), и для выделения NA* требуется провести генетическую рекомбинацию с более ранними вариантами  вируса  гриппа  для  того,  чтобы  получить НА*, инактивируемый в присутствии SDS (мигрирующий к аноду). NA штамма NWS (N1) денатурирует в присутствии SDS.

Б. ОЧИСТКА НЕЙРЛМИНИДАЗЫ

Вслед за солюбилизацией NA* из препаратов очищенного вируса ее можно выделить с использованием комбинации се-диментационных, хроматографических и (или) электрофоре-тических методов. Поскольку активный фермент имеет константу седиментации 8—10S, а другие вирусные компоненты могут иметь более низкие или 'более 'высокие скорости седиментации, обычно первым этапом очистки является ультрацентрифугирование, выполняемое чаще с использованием градиента либо сахарозы, либо глютамата натрия. Последний метод удобен тем, что при его использовании можно прямо измерить активность NA* с помощью тиобарбитуровой кислоты без нежелательного влияния сахарозы (Biddle, 1968). С помощью относительно низкоскоростного центрифугирования обычно отделяют NA* от вирусных частиц, а при втором центрифугировании с более высокой скоростью или с более крутым сахарозным градиентом отделяют медленно седимен-тирующие вирусные белки от NA*, которая седиментирует с большей скоростью.

Последующие этапы очистки обычно включают хромато-графические методы разделения макромолекул либо по размерам, 1как в случае гель-фильтрации с использованием се-фадекса G-200 или биогеля Bio-Red A5 (Kendal et al., 1968; Bucher, Kilbourne, 1972), либо методы разделения с использованием ионообменных смол, таких, как DEAE-целлюлоза, на которой NA* типа iNl довольно эффективно адсорбируется при нейтральных значениях рН (Gregoriades, 1972). Laver (1963, 1964) использовал метод электрофореза на целлюло-зоацетатных пластинах в присутствии SDS. В связи с тем что метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS позволяет проводить разделение 'макромолекул по размерам (Weber, Osborne, 1969), этот вид электрофореза был использован для выделения NA* вируса гриппа (Bucher, Kilbourne, 1972). Для изоляции из смеси белков солюбили-зированной с помощью детергентов NA* использовали и метод электрофокусировки (Gregoriades, 1972). Очистить NA* благодаря ее ферментативной активности можно методом афинной хроматографии при использовании колонки с низкомолекулярным ингибитором нейраминидазной активности — N-p-аминофенилоксамовой кислотой (Cuatrecasas, II-liano, 1971; Bucher, 1973, 1975). Если учесть, что NA* вируса гриппа представляет собой гликопротеид, ее можно выделить, используя афинную хроматографию с использованием лекти-нов (Hayman et al., 1973).

В. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ ОЧИСТКИ

После изоляции NA* из вирионов можно использовать несколько ^ критериев ее чистоты. Один из них — увеличение удельной активности в стандартных условиях. Если принять, что NA* составляет 7% всех белков вириона, то максимальное увеличение удельной активности препарата может составлять 14—15 раз. Однако этот критерий очень трудно использовать на практике, поскольку, с одной стороны, имеет место увеличение активности . NA* при выходе ее из вириона, а с другой — на ее активность одновременно влияет большое число денатурирующих факторов в зависимости от условий солюбилизации и типа используемого штамма вируса. В связи с этим очень трудно судить о степени очистки NA*, основываясь на ее удельной активности.

В качестве критерия чистоты препарата NA* использовали отсутствие адсорбции его на эритроцитах, однако, несмотря на наличие этого свойства, препарат все же может сохранять способность к индукции антител к НА* (Wilson, Rafelson, 1963; Drzeniek, Rott, 1963). Таким образам, дополнительным критерием степени чистоты выделенной NA* может быть то, что при ее использовании в качестве иммуногена не продуцируются антитела к другим компонентам вириона.

Поскольку в настоящее время: хорошо известно положение полосы NA* при электрофорезе в полиакриламидном геле, одним из критериев ее чистоты может быть присутствие одной полосы высойомолекулярногб гликопротеида при проведении электрофореза в невосстанавливающих условиях. После восстановлений эта полоса должна превратиться, в одну или две полосы, положение которых соответствует относительной молекулярной массе приблизительно 60 000 при полном отсутствии других полос. В этом случае на полиакрил-амидный  гель следует  нанести  5—10 мкг белка     

VI. СВОЙСТВА ИЗОЛИРОВАННОЙ НЕЙРАМИНИДАЗЫ А. СОСТАВ АМИНОКИСЛОТ

В связи с тем что NA*, полученная при действии на вирно-ны SDS, после удаления детергента агрегирует «хвостами», вероятно, за счет их гидрофобных свойств (см. 20; Laver, Valentine, 1969), и поскольку известно, что эти части молекулы NA* отщепляются при лротеолизе (Lazdins et al., 1972; Wrigley et al., 1973), интересно сравнить общее число полярных и неполярных остатков для NA* типа N2 (X7/F1), полученной с помощью детергентного (Laver, Baker, 1972) и лро-теолитического (Kendal, Eckert, 1972) методов. Естественно, что более надежно было бы провести такое сравнение, используя данные, полученные одной группой исследователей, однако, к сожалению, таких результатов в настоящее время еще нет. Если считать, что полярными аминокислотными остатками являются лизин, гистидин, аргинин, асларагино-вая кислота, треонин, серии и глутаминовая .кислота, то среди 535 аминокислотных остатков (см. ранее) имеется 280 полярных для NA*, выделенной с помощью детергентного метода, и 264 полярных остатка для фермента, изолированного с помощью протеолиза, т. е. в последнем случае наблюдается дефицит 6% полярных остатков. Если в качестве неполярных остатков рассматривать пролин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин и суммарный цистеин, можно видеть, что в NA*, изолированной с помощью детергента, содержится 186 неполярных остатков, a NA*, полученная при действии протеолитического фермента, включает 171 неполярный остаток, т. е. в процессе обработки ферментом теряется 8% неполярных аминокислотных остатков. Таким образом, аминокислоты в области, которая теряется при лро-теолизе молекулы NA*, не являются в значительной степени более гидрофобными, чем аминокислоты, входящие в состав активной части молекулы. Вероятно, конформация шолипеп-тидной цепи гораздо -более важна для создания гидрофобного характера этой области, чем тип аминокислот, входящих в ее состав.

Число остатков лизина и аргинина представляет интерес в связи с изучением пептидных карт гидролизатов нейраминидазы, полученных с помощью трипсина. Kendal и Eckert (1972) определили, что в каждой субъединице содержится 50,1 остатка лизина и аргинина, Layer и Baker дают величину 57,0 остатков. Данные по общему числу цистеиновых остатков этих авторов также существенно; отличаются. Kendal и Eckert (1972) определили 21 остаток: цистеина,.Laver и Baker (1972) — 14. Эти исследователи нашли также различное число метиониновых остатков:: для одного и того :же типа нейраминидазы Kendal и Eckert (1972) приводят величину 9,3, a Laver и Baker (1972) —5,9. Содержание остатков метиони-на в нейраминидазе важно для исследования структуры этого фермента, с , помощью его расщепления цианидом'брома,

которое происходит .по остаткам метионина. Основываясь на работе Kendal и Eckert (1972), можно предположить, что в результате такого расщепления образуется 9—10 фрагментов, а на основании работы Laver и Baker (1972) таких фрагментов должно наблюдаться 6 или 7. Для разрешения этого противоречия требуются дополнительные исследования по определению состава аминокислот.

Очень мало известно об углеводной части нейраминидаз-■ного гликопротеида. По Kendal и Eckert (1972), в молекуле фермента содержится 5,7 остатка глюкозамина. Lazdins и соавт. (1972) сообщили о потере при выделении нейраминида-зы с помощью протеолитических ферментов в области макромолекулы с высоким содержанием глюкозамина.

Б. АМИНОКИСЛОТЫ АКТИВНОГО ЦЕНТРА

Некоторые исследователи пытались определить природу аминокислотных остатков, входящих в активный центр NA*, однако полученные результаты были неоднозначны. Hoyle (1969) привел доказательства присутствия остатков тирозина и гиетидина в активном центре и не сделал 'каких-либо определенных заключений об остатках цистеина, метионина, триптофана, аргинина и лизина. С другой стороны, Bachmayer (1972), проведя исследование с N-бромсукцинимидной модификацией, с большой уверенностью указывает на наличие в активном центре триптофана. Изолированная с помощью проназы NA* вируса гриппа типа А2 (N2) полностью теряла свою активность после обработки N-бромсукцинимидом. Субстраты NA*, такие, как сиалиллактоза или фетуин, предохраняют фермент от подобного рода инактивации.

В. ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ ТОЧКА

Изоалектрическая точка была определена для NA*, полученной как протеолитическим (Neurath et al., 1970; Kendal et al., 1973), так и детергентным (Neurath et al., 1970; Grego-riades, 1972) методами. Neurath и соавт. (1970), Kendal и соавт. (1973) обнаружили большие различия в изоэлектри-ческих точках NA* типа N2 в зависимости от того, протеолитическим или детергентным методом был получен фермент. Gregoriades (1972) очищала NA* типа N1 (WSN) с помощью неионных детергентов и получила гомогенный препарат с изо-электричеокой точкой pi 6,0. Kendal я соавт. (1973) обнаружили при изоэлектрическом фокусировании NA* типа N2 по крайней мере 6 пиков в пределах pi от 5,2 до 6,5 с основными пиками в области 5,5—5,8. В обоих случаях изоэлектрическая точка была слегка сдвинута в кислую область. Дена-.турированная NA* (Kendal et al., 1973) имела изоэлектриче-

скую точку на 1,5—2,0 единиц рН ниже, чем нативный фермент, что указывает на возможное конформационное маскирование в нативной молекуле NA* большого количества боковых карбоксильных групп. Для NA*, выделенных из штаммов A2/Aichi/68 и B/Mass/66, Neurath и соавт. (1970) обнаружили пики pi в пределах рН от 5 до 9. Это указывает на то, что изоэлектрическая точка у вирусной NA* ближе к нейтральным значениям рН, чем у NA* Clostridium perfringens (pi 4,95) или Vibrio cholerae (pi 4,80), которые имеют фиксированные значения изоэлектрических точек. Neurath и соавт. (1970) не использовали детергент в опытах по электрофокусированию, хотя сама NA* была получена из вирионов с помощью детергента и в связи с этим возможным объяснением гетерогенности изоэлектрической точки может быть эффект агрегации. Gregoriades (1972) получила фиксированную изоэлектриче-скую точку при рН 6,0 для NA*, изолированной с помощью детергента в присутствии в среде неионных детергентов. Можно ожидать, что препарат NA*, выделенный с помощью обработки протеолитическими ферментами, гетерогенен за счет возможной множественности мест разрывов полипептидной цепи. Однако Kendal и соавт. (1973) обнаружили гетерогенность NA* даже после того, как отделили индивидуальный пик после изоэлвктрофокуоировки и снова нанесли его на фокусирующую колонку.

VII. СТРУКТУРА НЕЙРАМИНИДАЗЫ

Совершенно точно установлено, что NA* существует на поверхности вириона вируса гриппа в виде палочкообразных выступов. В настоящее время, однако, еще никто не достиг такого разрешения электронного микроскола, которое позволило бы обнаружить различие между «шипами» на вирусной поверхности и однозначно идентифицировать, какие из «шипов» являются NA*, а какие НА*. Laver и Valentine (1969) не смогли идентифицировать «шипы» NA* в связи с большой близостью этих поверхностных структур друг к другу. Как Kendal и Madeley (1970), так и Compans и соавт. (1969) указывают на выявление на поверхности вирионов после их инкубации совместно с антисывороткой к NA* областей, где концентрируются антитела. Следовательно, NA* может быть сосредоточена в локальных участках поверхности вириона. Эти наблюдения, кроме того, подтвердили тот факт, что NA* не локализована только у основания шипов, поскольку антитела прикреплялись к их'внешним концам.

Вне зависимости от того, протеолитичеаким или детергентным методом изолируется NA* из вирионов вируса гриппа, она седиментирует в области 8-—10S и имеет относительную молекулярную массу 200000—250 000. .Кроме того, NA*, изолированная с помощью  протеолитических ферментов,  имеет немного более низкую    скорость    седиментации и меньшую молекулярную массу, чем NA*, полученная из вирионов с помощью детергентов. Noll и соавт. (1962) рассчитали, что NA* типа  B/Lee, полученная с помощью сояюбилизации трипсином, имеет относительную молекулярную массу 190 000. Эти расчеты основывались на константе седиментации в 9S и парциальном удельном объеме   (V), равном 0,7 ом/г. Kendal и соавт. (1968) провели аналогичные расчеты для NA* типа N2, изолированной  с  .помощью   протеазы   Нагарсе,   и   получили молекулярную массу  220 000,  принимая  константу  седиментации равной 8S, a V=0,733 см/г. По данным Wrigley и соавт.   (1973), .которые  использовали  величины V = 0,719  см/г и 9S, .молекулярная масса NA*, выделенной из штамма B/Lee с  помощью обработки  вирионов    трипсином,    была    равна 207 400. Более высокие константы седиментации были получены для NA*, выделенной с помощью обработки детергентом. Webster  и  Darlington   (1969)   нашли  эту константу  равной 10,8S для NA* типа N2 (Х7)   (обработка твином-20), Bucher и  Kilbourne   (1972)   определили  величину  константы  в   11S для NA* типа N2  (Х7), при ее выделении с помощью SDS. При выделении с помощью SDS NA* вируса гриппа типа А имеет константу седиментации, равную  10S, и обработка ее проназой снижает эту константу до  9S   (Rott  et  al.,   1970). На основании опытов, проведенных в условиях восстановления, ^предполагалось, что активной формой NA* является тет-рамер (Kendal, Eckert, 1972; Bucher, Kilbourne, 1972; Lazdins et al.,. 1972). Несколько групп исследователей показали, что активные частицы с константой седиментации 10S могут диссоциировать на мономеры относительной молекулярной массой 50 000—60 000    после    обработки    восстанавливающими агентами, такими, жак меркаптоэтанол и датиотриэтол  (Webster, 1970а, b; Skehel, Schild, 1971; Kendal, Eckert,  1972; Bucher, Kilbourne,  1972; Lazdins et al.,  1972). Твердая уверенность в существовании тетрамерной структуры NA* возникла после публикации Wrigley и соавт. ('1973) их электронно-микроскопических снимков. На них выделенная с помощью про-теолитических ферментов NA* выглядит как планарная тет-рамерная частица, мономер которой представляет собой, скорее образование жубической, чем сферической, формы с длиной ребра около 4 нм  (19, см. 35). Если тетрамеры NA* выделяются с помощью SDS, то они сохраняют нитевидные образования, или «хвосты», длиной около 10 нм с утолщением на 'конце диаметром  около 4 нм   (Laver, Valentine, 1969; Wrigley et al.,  1973).

Тетрамерная структура является необходимым условием наличия активности NA* (Bucher, Kilbourne, 1972; Kendal, Eckert, 1972). Gregoriades (1972), проводя опыты по гель-фильтрации в градиенте, обнаружила ферментативную активность меньших, чем тетрамеры, образований. Однако, как ясно из наблюдений Bucher и Kilbourne (1972), в опытах Gregoriades NA* могла реасооциироватье образованием тетрамеров уже после элюции при гель-фильтрации. Хотя после хроматографии на колонке с (биогелем А-5 ('фирма «Bio Red» США), NA* и элюируется в виде частиц с относительной молекулярной массой 53000, фермент способен к спонтанной реассоциации в активные тетрамерные оубъединицы, что 'было показано центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (Bucher, Kilbourne, 1972). Различные уровни ассоциации мономеров с указанием их ферментативной активности приведены на 20.

Хотя дисульфидные связи и играют большую роль в поддержании тетрамерной структуры NA*, ino-видимому, они важны во внутримолекулярных и (или) в междимерных взаимодействиях, а не во взаимодействиях между всеми четырьмя субъединицами (см. 20) (Bucher, Kilbourne, 1972; Lazdins et al., 1972). Bucher и Kilbourne (1972) показали, что диффузия NA* при электрофорезе в полиакриламндном геле без  добавления  восстанавливающих  агентов происходит по

законам, справедливым для молекул с относительной молекулярной массой выше таковой тетрамеров (200 000—250 000). Lazdins и соавт. (1972), проводя эксперимент в невосстанав-лювающих условиях, 'нашли для NA* штамма B/Lee полосу, соответствующую молекулярной массе в 120 000. Для получения мономерных субъединиц ъ этих опытах было необходимо восстановить дисульфидные связи. Авторы этих работ предположили, что мономеры соединены друг с другом в ди-мерных образованиях дисульфидными связями, а связи димеров при формировании тетрамерных структур носят неко-валентный характер.

Хотя тетрамерная структура NA* в настоящее 'время твердо установлена, неясно, формируется ли она четырьмя эквивалентными мономерами (Kendal, Eckert, 1972; Wrigley et al., 1973)   или  двумя  типами  неэквивалентных мономеров   (Bucher, Kilbourne, 1972). Предполагают, что наличие в молекуле NA* одного или двух типов субъединиц зависит от штамма вируса.  То,  что  NA*   имеет  булавообразную  форму,  может означать наличие в ее составе более одного типа макромолекул. Исследователи, изучавшие NA* типа N2, изолированную из рекомбинантных штаммов Х7 и Х7   (F1)    с помощью де-тергентного метода, обнаружили два компонента, хотя разные авторы дают различные соотношения между количеством мономерных единиц двух типов  (Webster, 1970a; Skehel, Schild, 1971; Bucher,  Kilbourne,  1972;  Lazdins et al.,   1972).  Bucher и Kilbourne (1972) считают, что мономеры существуют в NA* в эквимолярных количествах; другие авторы показали более низкую .концентрацию для компонента с большей электрофо-ретической подвижностью   (Skehel,  Schild,   1971;  Lazdins  et .al., 1972). По данным Kendal и Eckert  (1972), в состав NA* реком-бинанта Х7  (F1) входит только один тип полипептида. Следует, однако, отметить, что авторы изолировали фермент с   помощью   протеолитического   метода.   Gregoriades   (1972) •обнаружила лишь один вид субъединиц для NA*  (N1), выделенный из вирионов гриппа штамма WSN. При исследовании .NA*,  выделенной  из  штамма  B/Lee,  был  также  обнаружен только один компонент   (Lazdins et  arl.,   1972;  Laver,  Baker, 1972; Wrigley et al., 1973).

Kendal и Kiley (1973) наблюдали только одну полосу лолипептида при электрофорезе после восстановления NA* Х7 (F1), выделенной из вирионов гриппа протеолитическим методом. Пептидные карты трипсиновых гидролизатов NA*, выделенной иротеолитическим методом, показали наличие только одного типа субъединиц. Такой вывод был сделан на основе подсчета числа радиоактивных сульфгидрильных групп (Kendal, Kiley, 1973). После расщепления трипсином ■субъединиц NA*, меченной 14|С с помощью карбоксиамидоме-тилирования, Kendal и Kiley  (1973) наблюдали около 20 пя-

тен при ауторадиографии пептидных карт, что с большой степенью вероятности указывает на присутствие в NA* только одного типа субъединиц, поскольку в них был найден 21 остаток суммарного цистеина. Если бы в NA* существовало два типа субъединиц, то должно было 'бы наблюдаться двойное (42) .количество пятен. Однако Laver и Baker (1972) обнаружили только 14 цистеиновых остатков. Поэтому двойное их количество должно быть равно 28, что в пределах экспериментальной ошибки совпадает с 20 пептидами, обнаруженными Kendal и Kiley (1972) на пептидных жартах. Можно также предположить, что число видов пептидов в NA* может зависеть от метода выделения фермента. Однако пептидные карты'NA*, полученные с помощью обоих методов, не показали существенных различий (Kendal, Bucher, неопубликованные данные).

Lazdins и соавт. (1972) предположили, что в случаях, когда наблюдалось два типа полипептидов, компонента с более высокой электрофорезяой подвижностью подвергалась про-теолизу. Kendal и Kiley (1973) придерживаются такой же точки зрения. Другое возможное объяснение может заключаться в различии углеводной части мономеров. Выяснение вопроса о различии двух типов мономеров NA, действительных или артефактных, связано с разделением и изоляцией этих мономеров. Наличие двух типов субъединиц в NA* увеличило бы трудности при ее генетическом изучении и вместе с. тем возможный потенциал ее генетической изменчивости.

VIII. АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА НЕЙРАМИНИДАЗЫ

Нейраминидаза считается важным в антигенном отношении компонентом вириона. Уникальность NA* вируса гриппа заключается в том, что она, будучи ферментом, играет, кроме того, роль антигена при заболевании гриппом. Антитела к NA* могут создавать защиту против гриппа и изменять течение болезни (см. гл. 12). Используя рекомбинантные штаммы, содержащие распространенную в настоящее время NA*, и серологически измененные гемагглютинины, Schulman и соавт. (1968) показали, что антитела к NA* ингибируют вирусную репликацию в клетках легкого мыши, уменьшают титр вируса и степень поражения легких.

Как и НА*, NA* подвержена антигенным сдвигам и дрейфу. Нейраминидазная компонента вириона меняется в процессе антигенной изменчивости (Paniker, 1968; Schulman, Kilbour-ne, 1969). Хотя новый тип вируса гриппа — тип А2 — возник в 1947 г. и при этом наблюдались очень существенные изменения НА* нейраминидазная .компонента нового типа давала положительный ответ в «росс-реакциях с NA* вируса гриппа

АО и поэтому N А* из обоих типов вируса были обозначены одним символом — N1 (Paniker, 1968; World Health Organization, 1972). В 1957—1958 гг. возник новый тип вируса А2. При этом образовался как новый НА* (N2), так и новая NA* (N2). Как показал Rafelson и соавт. (1963а, Ь), в этом случае кросс-реакции между антисыворотками к азиатским штаммам (N2) и антисыворотками к PR8 (N1) или к вирусу гриппа В отсутствовали. Штамм, возникший в 1968 г., обладал новым типом НА* (НЗ), а его NA* — высокий кросс-реактивностью со штаммами вируса триппа А2 и в связи с этим для ее обозначения был вновь использован символ N2 (World Health Organization, 1972). Однако небольшое изменение, так называемый антигенный дрейф, все же наблюдалось в 10-летние периоды, отделяющие 'кардинальные антигенные сдвиги (Schulman, Kilbourne, 1969).

Взаимодействие «ейраминидазы с антителами может быть изучено с помощью нескольких методов. К ним относятся такие методики, как ингибирование ферментативной активности (Fazekas de St. Groth, 1962, 1963; Aymard-Hanry et al., 1973), иммунопреципитация (Easterday et al., 1969; Schild, Pereira, 1969; Palese et al., 1973), определение уменьшения размера бляшек (Jahiel, Kilbourne, 1966) и тесты титрования на мышах (Schulman et al., 1968). Полосу иммунопреципита-ции можно наблюдать после проведения иммунодиффузии при использовании низ'комолекулярного хромофорного субстрата МФН (Palese et al., 1973).

Наиболее широко распространенной методикой определения наличия антинейраминидазных антител является реакция торможения нейраминидазной активности с использованием высокомолекулярных субстратов — гликопротеидов, содержащих нейраминовую кислоту. Уровень ингибирования антителом не зависит от (концентрации субстрата (Fazekas de St. Groth, 1963; Rafelson et al., 1963a). Реакция подавления нейраминидазной активности была стандартизована, причем в этом случае в качестве субстрата использовали фетуин, а за степень подавления активности -принимали величину разведения исходного раствора антител, при котором наблюдается 50% подавление нейраминидазной активности (Aymard-Hen-ту et al., 1973). Если откладывать на графике процент ингибирования в зависимости от логарифма разведения антисыворотки, должна получиться прямая линия. Обычные условия проведения этого теста: 1,2% концентрация фетуина в 0,1 М фосфатном буфере, рН 5,9 тз присутствии 1,5 ,мМ СаСЬ в объеме 0,2 мл. Чувствительность реакции возросла за счет увели-.. чения времени инкубации нейраминидазы с антисывороткой и субстратом (17 ч при 37°С).

Было обнаружено, что степень ингибирования нейраминидазной активности за счет взаимодействия с антителами за-

висит от размеров молекулы субстрата (Fazekas de St. Groth,. 1963; Rafelson et al., 1963). Такая же зависимость наблюдалась и для нейраминидазы Vibrio cholerae (Mohr, Schramm, 1960). Было показано, что нейраминидазная активность вируса гриппа ингибируется специфическими антителами, если: в качестве субстрата использовать высокомолекулярный субстрат (орозомукоид, фетуин или лликопротеид, выделенный, из мочи), и ингибируется слабо или вообще не ингибируется при использовании низкомолекулярных субстратов, таких,, как сиалиллактоза. Это указывает «а то, что ингибирование активности нейраминидазы—стерический процесс, т. е. антитело взаимодействует не с активным центром фермента, а с соседним участком (или участками), и степень ингибирова-ния возрастает с ростам относительной молекулярной массы используемого в реакции субстрата (Fazekas de St. Grothr 1962).

Сравнивая штаммы вируса гриппа А и В, Fazekas de St.. Groth (1963) обнаружил, что в вирионах штамма АО (Mel) нейраминидаза расположена таким образом, что легкодоступна для нейтрализации антителами, и -максимальная: степень ингибирования при использовании одного и того же субстрата выше для штамма А0(Ме1), чем для штамма B/Lee. Для штамма вируса гриппа А2 наблюдалось стериче-ское ингибирование антителами при использовании высокомолекулярных субстратов и слабое — при использовании в качестве субстрата сиалиллактозы. В отличие от этого для штамма вируса гриппа В ингибирование отсутствовало при использовании сиалиллактозы, 80% ингибировались при использовании высокомолекулярных субстратов (таких, как фетуин, орозомукоид и мукоид мочи, обработанный трипсином) и 100% при использовании очень больших субстратов (эритроциты, мукоид мочи и овомуцин). Это может свидетельствовать о том, что в штаммах вируса гриппа В расстояние между антигенным и активным центром больше, чем в штаммах гриппа А.

При расщеплении антител с помощью папаина стериче-ское ингибирование резко уменьшается, хотя константа связывания антител в обоих случаях одинакова. Кроме того, ингибирование нейраминидазной активности носит неконкурентный характер и зависит от: 1) расстояния между антигенной детерминантой и активным центром фермента; 2) размера и формы молекулы субстрата; 3) размера молекулы антитела. Оценка величины расстояния между антигенным и активным участками нейрамияидазы дала величину 2 им (Fazekas de St. Groth, 1962). Эти эксперименты -были проведены с антисывороткой к цельной вирусной частице, содержащей антитела как к гемагглютинину, так и к нейраминидазе. Для подтверждения приведенных выше выводов необходимо провести.

аналогичные эксперименты с использованием моноспецифической сыворотки к нейраминидазе.

То, что активный центр фермента не принимает участия в выработке антител, характерно не только для нейраминидазы. По-видимому, это свойство присуще некоторым другим ферментам и является показателем отсутствия мутабельности активного центра у биологических видов (Cinader, 1967). Одним из объяснений этого феномена может быть то, что, если бы организм распознавал активный центр вирусной NA* так же, как активный центр своей собственной NA*, он не смог бы выработать антитела к вирусному ферменту.

Антитела к НА* в различной степени ингибируют активность NA* некоторых штаммов вируса гриппа (Paniker, 1968; Webster, Pereira, 1968). Ингибирование активности NA*, вызванное антителами к НА*, несмело места, если NA* (Х7) изолировали из вириона с помощью твина-20 (Webster, 1970a), SDS 'или лроназы (Easterday et al., 1969). И, наоборот, антитела к NA* могут подавлять гематтлютинацию некоторых штаммов вируса гриппа (Kilbourne, 1968; Schulman, Kilbourne, 1969). Однако в большинстве случаев антитела к NA* не ингибируют реакцию гемагглютинации, но эффективно -подавляют элюцию вируса (Brown, Laver, 1968). Реакция ингиби-роваяия .гемагплютинации была использована для выявления антител к NA* рекомбинантов Х15 « Х15 (НК) (Kendal et al., 1972). Чувствительность этого теста была повышена при использовании IgG-антител человека (Kendal et al., 1972) (см. также гл. 11).

IX. ЛЕКТИНЫ И НЕЙРАМИНИДАЗЫ

Конканавалин А, являясь лектином и фитогемагллютини-ном, ингибирует, подобно специфическим  антителам,  актив-% ность NA* вируса гриппа в случае, когдавкачествесубстрата :  используют высокомолекулярные соединения, такие, как фе-: гуин (Palese et al., 1973; Zalan et al., 1974). Конканавалин А .агглютинирует вещества, имеющие в своем составе a-d-плю-копиранозидные,  a-d-маннопиранозидные  и ia-d-фруктофура-нозидные    ядра    (Goldstein et al.,    1965;    Goldstein,    1965). Как и у антител, линия преципитации NA* может быть обна-,   ружена при иммунодиффузии с использованием низжомолеку-лярного хромофорного субстрата МФН, если вместо антисыворотки взять раствор конканавалина А, а диффузию прово-. дить против разрушенного вируса. Это явление имеет место, даже несмотря на то, что конканавалин А подавляет активность NA* при использовании высокомолекулярного субстрата  (Palese et al., 1973). Таким образом, конканавалин А ведет себя подобно антинейраминидазньщ антителам, т. е. блокирует активный центр  фермента не непосредственно, а  за счет стер'Ического эффекта.

jRott и соавт. (1972) продемонстрировали преципитацию NA* с помощью конканавалина А, полагая, что этот эффект связан с взаимодействием конканавалина с одним из поверхностных компонентов. Эти авторы, .кроме того, показали, что добавление конканавалина А к фибробластам куриного эмбриона, инфицированным вирусом FPV, предотвращает оборку или отделение вируса от клетки. Если вирус разрушался с помощью тритона Х-100, то гемагглютинирующая активность обнаруживалась в супернатанте, a NA* выпадала в осадках вместе с конка'навалином А. Однако, если NA* изолировали с помощью протеолитического фермента, только 7з ее осаждалась «онканавалином А, а 2/з оставались в растворе. Следовательно, при лротеолитическом выделении NA* от нее отщепляется фрагмент с высоким содержанием углеводов, как это уже было показано Lazdins и соавт. (1972), которые использовали в своей работе другие методы.

Ранее Zalan и соавт. (1974) высказали предположение, что активность NA* блокируется конканавалином А через взаимодействие с гемагглютинином. Однако изолированная NA* блокировалась в той же степени и тем же образом, что и NA* in situ.

Была обнаружена штаммовая зависимость ингибирования с помощью конканавалина А. Вероятно, углеводные остатки NA на поверхности вир иона легкодоступны и высвобождение фермента не обнажает .какие-либо скрытые ранее области. Кроме того, изолированная NA* может адсорбироваться на сефарозу с ковалентно связанным с ней (конканавалином А (фирма «Pharmacia», Швеция), а НА* не обладает такой способностью (Zalan, персональное сообщение). Работы Rott и соавт., а также Zalan показали, что углеводные компоненты NA* и iHA* существенно различны.

Нейраминидаза, как и НА*, адсорбируется колонкой с фи-тогемагглютинином, выделенным из Lens culinaris (Hayman et al., 1973). Этот лектин чувствителен к присутствию глюкозы, маннозы и стерически подобным им остаткам Сахаров (Stein et al., 1971). Исследования с использованием лектинов должны помочь выяснить локализацию активного центра в молекуле NA и получить информацию о природе ее углеводной части.

X. ИНГИБИТОРЫ АКТИВНОСТИ НЕЙРАМИНИДАЗЫ

ИнгИ'бирова'ние активности NA* можно вызвать не только используя антитела или лектины, но и с помощью некоторых других веществ. Ингибиторы активности NA* могут быть как синтетическими, так и природными, низко- или высокомолекулярными, высоко- и низкоспецифичными. Интерес к изучению  ингибиторов    объясняется    тем,     что  они  могут   быть

использованы как химиотерапевтические средства против вирусов, содержащих NA*.

Вещества, ингибирующие активность NA*, обычно не действуют на НА*, хотя оба этих вирусных белка взаимодействуют с «ейраминовой кислотой. Сиалиллактоза расщепляется , NA*, но не является ингибитором гемагглютинации (Bogoch, 1957). Орозомукоид также не ингибирует реакцию гемагглютинации, хотя и расщепляется NA* (Mayron et al., 1961). ; Нейраминовая кислота подавляет активность NA*, но не подавляет гемагглютинации (Odin, 1952).

В работах Drzeniek (1966, 1970), Becht и Drzeniek (1967) было наказано, что .полианионы оказывают заметное ингиби-рующее действие на вирусную NA*. Рибо- и дезоксирибонук-леиновые кислоты, сульфат декстрана, .муцин подчелюстных желез свиньи и гепарин в концентрациях от 0,005 до 0,5 мкг/мл подавляют активность NA*, выделенных из вирио-нов гриппа и парагриппа. Синтетические и неорганические полианионы, такие, как трипан красный, конго красный, а также фосфовольфрамовая и жремниевольфрамовая кислоты в концентрациях 10~4 и 10"7 М также ингибируют NA вирусов FPV/Rostock/34 и вирусов гриппа А2. Активность этих соединений, однако, не является специфичной, поскольку их ингибирующее действие элиминируется малыми коли- • чествами поликатионов, такими как поли-1-лизин.

Сульфгидрмльные препараты, такие, как тиогликолат, глютатион, цистеин, мертиолат и Hg2+, ингибируют активность NA* вирусов гриппа штаммов А2-Япония/305/57 (H2N2) и PR8 (H0N1), хотя их концентрация для 50% ингибирования должна быть достаточно высока и находится в пределах от 10~2 до 10~3 М (Rafelson et al., 1963а). Высокие концентрации ЭДТА  (10~2—10~4 М)   также оказывают  ингибирующее

действие.

Было показано, что 'большое количество структурно несходных соединений подавляет активность NA* вирусов гриппа (21). Edmond и соавт. (1966) обнаружили, что производные фенилглиоксаля и производные оксамовых кислот ингибируют NA* вируса гриппа А/Англия/1/61 (H2N2). Самый эффективный ингибитор из этой группы соединений — N-фе-нилоксамовая кислота — подавляет ферментативную активность на 50% в концентрациях 2-10~4—5-10~4 М. Несмотря на то что производные оксамовых кислот являются неспецифическими ингибиторами NA*, взаимодействующими с ферментами, не имеющими отношения к нейраминовой кислоте, например с лактатдегидрогеназой, аминофенилоксамовая кислота, соединенная с помощью ковалентной связи с твердым матриксом, была успешно использована для очистки бактериальных и вирусных NA* (Cuatrecasas, Illiano, 1971; Bucher, 1973). Некоторые из соединений, описанных Edmond и соавт. (1966), оказывают слабое антивирусное действие на репродукцию еирионов штамма PR8 (H0N1) в аллантоисных мембранах, но теряют это свойство, когда вирус выращивается на куриных эмбрионах. Haskell и соавт. (1970) описали другой класс ингибиторов кислых NA*, являющихся производными |3-,арил-а-меркаптоакр;иловой кислоты (см. 21). Эти ингибиторы на 50% подавляют действие вирусных и бактериальных NA* также при относительно высоких концентрациях (5-10~4 М). Другая группа ингибиторов NA*, производные аминофенилбензоимидазолов, интересны в том отношении, что они являются основными в отличие от описанных выше соединений, во всех молекулах которых содержится карбоксильная группа. Однако бензоимидазольные производные также являются относительно слабыми ингибиторами активности NA* (Haskell et al., 1970).

Производные дигидро- и тетрагидрохинолина ингибируют активность NA* и являются активными противогриппозными препаратами (Brammer et al., 1968; Haskell et al., 1970). Препараты были опробованы на мышах и людях (Brammer et al., 1968). Недавно Schinkai и Nishimura (1972) установили, что хотя исследованные ими два -производных изохинолина и не ингибируют действие NA*, однако их присутствие мешает определению активности NA* с помощью тиобарбитуровой кислоты. В свете этих данных эксперименты, проведенные Brammer и соавт. (1968), Tute и соавт. (1970), Haskell и соавт. (1970), требуют дополнительной проверки.

'Пытаясь создать 'специфические ингибиторы NA*, некоторые исследователи синтезировали соединения, являющиеся структурными производными N-ацетилнейраминовой кислоты. Как было показано ранее, сама N-ацетилнейраминовая жис-лота является слабым ингибитором NA* вируса гриппа А/'Син-гапур/1/57 (H2N2) с величиной Ки=5-10~3 М, сравнимой со значением Км = 6-10"4 М для сиалиллактозы. А. Я- Хорлин и соавт. (Khorlin et al., 1970) показали, что 2-дезокси-2-я-нитрофенилтио-М-ацетил-а-б-нейрамйяовая кислота, а-кето-зид N-ацетилнейраминовой кислоты, являются конкурентными ингибиторами NA* Vibrio cholerae с Ки = 2,3-10-4 М пр« Км=1,67-10-3 М для N-ацетилнейраминиллактозы. Другой аналог нейраминовой кислоты — б^лактон 3-азо-2,3,4-три-дезокси-4-оксо-с1-арабинооктоновой .кислоты даже 'более эффективен (Ки = 4-10""5 М) для подавления активности NA* V. cholerae (см. 21). Оба соединения обладали ингиби-рующей активностью по отношению ко всем исследованным вирусным NA*.

Недавно 'были синтезированы производные дезоксинейр-аминовой кислоты, обладающие способностью специфически блокировать активность NA* (Meindl, Tuppy, 1969a, 1973). Конкурентным ингибитором NA* v. cholerae является 2-дезок-си-2,3-дегидро^-ацетилнейраминовая кислота. Это вещество обладает высоким сродством ж бактериальному ферменту (Ки=Ы0-5 М) и способностью подавлять репродукцию мик-совирусов в культуре ткани (Meindl, Tuppy, 1963b; Meindl et al., 1971). 2-Дезокси-2,3-дигидро-Ы-ацетилнейраминовая кислота отличается от М-ацетилнейраминовой кислоты только наличием двойной связи между 2-м и 3-м атомами углерода. Производные этого соединения, получаемые при замещении N-ацетильной группы на N-флуоро-, N-дифлуоро-, N-трифлу-оро- или N-хлорацетильную группу, являются еще более эффективными ингибиторами (Meindl et al., 1974). Восемнадцать производных этого типа были исследованы на ингибирую-щую активность против различных NA* вирусов гриппа. Наиболее активное производное — 2-дезокси-2,3-дигидро-г\[-Т'ри-флуороацетилнейраминовая кислота (ФАНК)—конкурентно ингибирует активность NA* вируса гриппа A/Mel/35(HON1) с Ки = 7,9-10~7 М. Таким образом, ФАНК — наиболее эффективный из известных ингибиторов NA*. Сродство вирусных NA* к низко- и высокомолекулярным субстратам примерно в

1000 раз ниже, чем к ФАНК (Meindl et al., 1974; Schulman, Palese, 1975). ФАНК ингибирует активность фермента'«а 50% при концентрациях порядка 2• 10~6—5-10~б М при концентрации субстрата 10~3М «, вероятно, специфична для NA* и реакций, в которых присутствует нейраминовая кислота. Гематглютинацию вирусов гриппа типов А и В ФАНК не ин-ги-бирует, но влияет на гемагглютинацию вирусов парагриппа, NDV и SV5 в концентрациях выше Ю-7 и 10~6 М соответственно. Поскольку тем не менее гемагглютинирующую активность вируса Сендай ФАНК не ингибирует, нельзя утверждать, что ее свойство ингибировать гемагглютинацию универсально для всех вирусов парагриппа (Meindl et al.y 1974).

Недавно было показано, что ФАНК ингибирует репликацию вируса гриппа в культуре ткани. ФАНК подавляла репродукцию всех исследованных вирусов гриппа (Palese et al., 1974а; Palese, Schulman, 1975). Однако были обнаружены различия в чувствительности различных штаммов к этому ингибитору. Вирусы, имеющие в своем составе NA* типа N1 . (вирус, гриппа WSN (H0N1) ингибировались по тесту уменьшения размера бляшек при концентрации ФАНК 2-10~6—• 4-10~6, вирусы, содержащие NA* типа N2 — рекомбинант Х7 (H0N2), требовали в 50—100 раз более высоких концентраций ФАНК для получения той же степени ингибирования. То, что вирусы, содержащие один и тот же тип НА* и разные типы NA*, по-разному ингибируются ФАНК, указывает на то,, что антивирусное действие ФАНК заключается в специфическом подавлении активности NA* (Schulman, Palese, 1975). Кроме того, эту точку зрения подтверждает и то, что ФАНК не влияет на репликацию других оболочечных вирусов, таких, как вирус кори или вирус везикулярного стоматита, не имеющих в своем составе NA (Kilbourne et al., 1974; Palese et al., 1974a).

XI. РОЛЬ НЕЙРАМИНИДАЗЫ

Более чем за 30 лет, прошедших после открытия NA:|\ появилось несколько теорий, объясняющих функцию этого фермента в вирионе. Наряду с возможной физиологической ролью, заключающейся .в удалении нейраминовой кислоты муцинов, которые являются ингибиторами NA*, предполагалось, что в процессе репликативного цикла она играет определенную роль либо при проникновении вируса в «летку, либо при высвобождении из клетки вновь синтезированного вируса. В последнее время появились данные о том, что NA* осуществляет еще и четвертую функцию — предотвращает агрегацию образовавшихся вирусных частиц.

На самом раннем этапе исследований предполагалось, что NA* ответственна за проникновение вируса гриппа в чувствительные клетки после того, как вирус прикрепился к поверхностным молекулам нейраминовой кислоты, а для проникновения вирионов в клетку необходимо отщепление этой кислоты (Hirst, 1942). Против этой точки зрения имеется несколько возражений. Вирус с инактивированной при помощи тепловой обработки NA* продолжает проникать в клетку (Faze-kas de St. Groth, 1948), репродуцируясь совместно с активным вирусом (Isaacs, Edney, 1950) и участвуя в генетической рекомбинации с другими вирусами (Burnet, Lind, 1954). Удаление NA* с помощью протеолитических ферментов оказывало влияние на инфекционность штамма WSN (H0N1) (Schulze, 1970). После ингибирования активности NA* с помощью ингибитора ФАНК при концентрации 10~3М, когда происходит практически полное подавление активности фермента, не наблюдается изменение проникновения вируса в клетку (Schulman, Palese, неопубликованные данные). Антитела к NA* не воздействуют на инфекционность вируса гриппа (Seto, Rott, 1966; Jahiel, Kilbourne, 1966; Webster, Laver, 1967; Kilbourne et al., 1968). Все эти факты свидетельствуют о том, что активность NA* не существенна на ранних этапах репликации вируса гриппа. Можно, однако, предположить, что инактивация или удаление NA с помощью тепловой обработки, протеолитических ферментов, ингибиторов или антител в описанных выше опытах является неполным и что остаточная активность фермента достаточна для осуществления первых этапов репродукционного цикла.

Hoyle (1950) предположил, что NA* воздействует на клеточные субстраты и участвует в процессе отпочковывания вируса от клеточной поверхности. Padgett и Walker (1964) пришли к такому же заключению, показав, что один из вариантов вируса гриппа B/Lee, обладающий низкой активностью NA*, отпочковывается от клеток со скоростью, меньшей, чем у обычного вируса штамма Lee. Указанный вариант, кроме того, имел более низкую скорость роста в процессе репликации. В свете недавних экспериментов с вариантами вируса гриппа типа А, которые различаются друг от друга по содержанию NA* (в 8—10 раз), можно предполагать, что корреляция активности NA* со скоростью роста и выхода вируса из клетки может определяться типом клетки-хозяина.

Если варианты с высоким содержанием NA* реплицировались с более высокой скоростью в куриных эмбрионах и хорионаллантюисных мембранах, то варианты с низким ее содержанием реплицировались до более высокого титра в клане клеток 1-5С-4 (Palese, Schulman, 1974; Schulman, неопубликованные данные).

Аргумент в пользу того, что NA* участвует в высвобождении вируса из «летки, подтверждается экспериментами, в которых антинейраминидазные антитела не влияли на адсорбцию вируса, но подавляли выход вновь синтезированного вируса из клетки (Seto, Rott, 1966; Jahiel, Kilbourne, 1966;. Webster, Laver, 1967; Kilbourne et al., 1968; Compans et al.,. 1969). Предполагалось, что антитела 'Предотвращают отщепление концевых нейраминовых кислот и таким способом блокируют отделение вирусных частиц, (прикрепленных к молекулам «ейраминовой .кислоты на 'клеточной мембране. Эта схема была подтверждена экспериментами, в которых подавление десорбции вирусных частиц в присутствии антител частично снималось с .помощью добавления избытка бактериальной NA* (Compans et al., 1969; Webster, 1970a). Becht и соавт. (1971.) не подтвердили эти результаты и показали, что .моновалент-ные антитела NA*, присутствующие во время одного цикла репликации вируса, неспособны 'блокировать отделен](е вм-рионов, хотя и подавляют активность NA*. Другого рода экспериментальные данные также заставляют усомниться в ключевой роли NA* во время десорбции вируса. Одинаковое количество нейраминовой 'кислоты отщепляется от инфицированных клеток в присутствии или в отсутствие антител к NA. (Dowdle et al., 1974). Максимально активно NA* синтезируется задолго до момента отпочковывания вируса (Schlesin-ger, Karr, 1957; Lipkind, Tsvetkova, 1973).

Совсем недавно активность бивалентных антител NA* была объяснена на основе их не а'нтинейраминидазной активности,, а способности служить мостиками (или скрепками) междуотдельными вирионами (впервые это предположили Kilbourne и Schulman, 1965) и прикреплять вирусные агрегаты к клеточной поверхности (Kendal, Madeley, 1970; Becht et ai.(, 1971; Dowdle et al., 1974). Естественно, что это свойство антител может быть не единственным механизмом, с помощью которого эти антитела ингибируют репродукцию вируса. В противовес экспериментам Becht и соавт. (1971) с помощью более чувствительного метода редукции размера бляшек, предполагающего наличие многоцикловой вирусной репродукции, было показано, что антитела к NA* ингибируют репликацию вируса (Kilbourne et al., 1974). Во время много-цикловой репликации даже небольшое уменьшение урожая вируса умножается за счет повторения в каждом последующем цикле репродукции. Эти результаты указывают на то,, что по 'крайней мере часть ингибирующей активности антител можно отнести за счет специфического ингибирования NA*. Эксперименты с ФАНК — низкомолекулярным ингибитором NA*, описанные ранее, подтверждают точку зрения, что инги-бирование активности NA влияет на репликацию вирусов, содержащих NA* (Palese et al., 1974a; Schulman, Palese, 1975),

и указывают на то, что активность NA* все же существенна для процесса репликации вируса.

Новая теория роли вирусной NA*, заключающейся в предотвращении вирусной агрегации, была предложена после проведения экспериментов с ts (температурочувствительными) мутантами вируса гриппа. Эти эксперименты указали еще раз на важную роль фермента в цикле репликации вируса гриппа-(Palese et al., 1974b, c). Sugiura и соавт. (1972) изолировали ts-мутанты вируса гриппа WSN (HON1), каждый ,из которых попадал в одну из нескольких комплементационных групп. Было показано, что два из этих мутантов являются нейрами-нидазодефектными (Palese et al., 1974b). При непермиссивных температурах нейраминидазодефектные мутанты дают частицы, содержащие нейраминовую кислоту в своей оболочке и образующие большие агрегаты. Ранее было показано,, что оболочка частиц вируса гриппа и участки клеточных мембран, где отпочковывается вирус, лишены нейраминовой кислоты, вероятно, за счет присутствия вирусной NA* (Klenk et al., 1970). Было высказано предположение, что удаление нейраминовой кислоты может быть необходимым этапом сборки вирусной частицы (Klenk et al., 1970). Результаты, полученные с помощью нейраминидазодефектных мутантов, указывают на то, что морфологически интактные вирусные частицы с нейраминовой кислотой на поверхности своей оболочки могут отпочковываться от клетки, но делают это в виде агрегатов, а не индивидуальных вирионов (22). В связи с тем что в этом случае вирионы имеют сиаловую кислоту на своей поверхности, НА* соседних вирусов могут «принять», вирусный чехол за рецептор и скрепить вирионы друг с другом, что приведет к образованию больших агрегатов. Интересные результаты были получены Schulze (1975) при изучении эффектов, сопровождающих искусственное прикрепление сиаловой кислоты к поверхности вируса гриппа штамма WSN in vitro. Эта процедура также приводила к образованию небольших агрегатов (см. гл. 3). Наблюдаемое при этом увеличение инфекционности вируса после прикрепления к его-поверхности in vitro сиаловой кислоты можно объяснить объединением неинфекционных вирионов в агрегаты по 2—4 частицы. Такой же феномен описали Hirst и Pons (1973).

Теория о такой функции NA* предполагает, что только те-вирусы, которые, имеют в своем составе гемагглютинин,. взаимодействующий с сиалосодержащим рецептором клеточной поверхности (т. е. орто- и парамиксовирусы), требуют наличия нейраминидазы. Этим объясняется, почему другие отпочковавшиеся от поверхности вирусы нейраминидазы не содержат. Основываясь на довольно ограниченных данных, можно, вероятно, утверждать, что такие вирусы, 'как РНК-со-держащие онкогениые вирусы, вирусы VSV, Синдбис и раб-довярусы, содержат «а своей поверхности нейраминовую кислоту (Burge, Huang, 1970; Klenk, Chippin, 1971; Lay, Dues-berg, 1972; Schulumberger et al., 1973; Krantz et al., 1974).. Включение нейраминовой кислоты в оболочку всех отпочковывающихся вирусов может происходить в процессе их созревания, только орто- и парамиксовирусы должны удалять со< своей поверхности нейраминовую кислоту для того, -чтобы предотвратить агрегацию.

При изучении вирусов, обладающих температурочувстви-тельной нейраминидазой, с помощью метода электронной: микроскопии было обнаружено, что эти вирусы охотнее агрегируют друг с другом, чем адсорбируются на рецепторах клеточных мембран, содержащих нейраминовую кислоту. Одно-из объяснений указанного выше фа^та может заключаться в том, что во время отпочкования вир ионы 'находятся в очень тесном контакте друг с другом на поверхности мембран и при десорбции с клетки остаются прикрепленными друг « другу, а не переходят на поверхность клетки. На 22 можно видеть феномен агрегации нейраминидазодефектных мутант-ных вирусов, растущих при непермиссивных температурах. Подобный эффект можно наблюдать, если мутант выращивают при пермиссивных температурах в присутствии ФАНК, ингибитора нейраминидазной активности. При этих условиях действие вирусной нейраминидазы подавляется, а вирионы имеют в своем составе рецепторы, содержащие нейраминовую кислоту, что является причиной их агрегации (Palese,, Compans, 1975).

Кроме того, функция вирусной нейраминидазы заключается, очевидно, в отщеплении остатков нейраминовой кислоты от клеточных мембран и слоев муцина, что предотвращает реадсорбцию вируса на этих рецепторах. Этот факт может быть особенно важным в естественном инфекционном процессе, когда вирус взаимодействует со слоями муцина или другими ингибиторами гемагглютинации. Нейраминидаза же-может не только дезагрегировать вирусные частицы, но и предотвращать их адсорбцию на этих гликопротеидах, что позволяет вирионам инфицировать новые чувствительные клетки. Таким образом, нейраминидаза может осуществлять в репликативном цикле не одну, а несколько функций.